六价铬致肝脏损伤作用机制的生物信息学分析_王睿.pdf
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1、第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.2Mar.2023DOI:10.13481/j.1671587X.20230221六价铬致肝脏损伤作用机制的生物信息学分析王睿1,章鼎2,诸葛瑞剑1,薛倩1,郭丽1(1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院脊柱外科,吉林 长春 130033)摘要 目的目的:通过生物信息学方法识别六价铬 Cr()致 肝 脏 损 伤 的 相 关 基 因,为探讨Cr()致机体肝脏损伤作用机制的
2、研究提供新的方向。方法方法:检索基因表达综合(GEO)数据库中与“Cr()liver”相关数据集,下载数据集 GSE65198,通过 limma 包筛选差异表达基因(DEGs),并进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,采用 String数据库进行蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析,Cytohubba插件筛选 hub基因,通过 Enrichr网站使用药物特征数据库预测靶向药物分子。结果结果:选择数据集 GSE65198 中的样本 20 例,分为 2 组。第 1组 20 mg kg1 Cr()1次暴 露 后 1 d 肝 脏 样 本 和 对 照 样 本各 5例
3、;第 2组 20 mg kg1 Cr()1次暴露后 7 d肝脏样本和对照样本各 5例,以每组的对照样本作 为 阴 性 对 照 分 别 筛 选 得 到 342个和61个 DEGs(|Log2 FC|1和 P1 and P0.05).The GO enrichment analysis results showed that the DEGs were mainly enriched in the biological processes such as the drug response,mitosis,senescence and so on;the KEGG analysis results
4、 showed that the main signaling pathways included the ribosome biogenesis,cell cycle regulation,and p53 signaling pathway and so on.The hub gene analysis results in the PPI network showed that the EBNA1 binding protein 2(EBNA1BP2),nucleolar protein 58(NOP58),guanine nucleotide binding protein like 3
5、(GNL3),nucleolar protein 56(NOP56),and WD repeat domain 12(WDR12)in 1 d group after single exposure and cyclin B2(CCNB2)(the identifier in PPI network was ENSRNOP00000017117),cyclin A2(CCNA2)cyclin B1(CCNB1),cyclin dependent kinase 1(CDK1),and kinesin family member 20B(KIF20B)in 7 d group after sing
6、le exposure were screened as the hub genes.The targeted drug prediction results showed that roscovetine and other drugs were identified as the targeted drugs for liver injury by induced Cr().Conclusion:The mechanism of liver injury induced by Cr()may be related to cell cycle regulation-related genes
7、,and roscovitine may be the potential clinical treatment drug.KEYWORDS Hexavalent chromium;Liver;Bioinformatics;Differentially expressed genes;Injury六价铬 hexavalent chromium,Cr()是环境中常见的重金属污染物,常以铬酸根离子的形式存在,具有较强的氧化活性和化学毒性1。在生产生活中,Cr()可通过呼吸系统、消化系统和皮肤接触进入人体,对肝脏、肾脏、心脏和脾脏等器官造成急慢性损害1-2。Cr()经口暴露后,在机体内发挥主要毒作用
8、及生物代谢作用的靶器官是肝脏1。目前关于 Cr()致肝脏损伤的毒作用机制包括:经 Cr()暴露的肝组织中出现炎细胞浸润3;Cr()会导致肝细胞内稳态失衡,引发氧化应激反应,还原过程中会产生过渡价态铬和活性氧(active oxygen,ROS)4,还原产物还会与 DNA 结合形成 Cr-DNA 加合物5,导致 DNA 损伤或染色体畸变6;Cr()进入肝细胞会破坏线粒体膜结构,使线粒体功能受损,过量 ROS 蓄积影响能 量 代 谢 诱 导 肝 细 胞 凋 亡7;Cr()会引起肝细胞外钙离子内流,钙离子超载会影响细胞对损伤的敏感性,进一步导致细胞凋亡和坏死8;低浓度 Cr()暴露会引起肝细胞 DN
9、A 合成期阻滞,高浓度则会引起 DNA 合成后期和分裂期阻滞9;Cr()也可以通过内质网应激途径诱导肝细胞凋亡10。但是 Cr()致肝脏损伤的毒作用机制尚未完全阐明。以往对于Cr()致肝脏损伤机制的研究缺乏对生物信息学的整合和对关键通路的识别,且目前国内外也缺少生物信息学方面报道,全面系统地研究基因表达谱的变化有助于更好地阐明 Cr()致肝脏损伤的潜在分子机制。本研究利用基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库11的高通量测 序 数 据 GSE65198,筛 选 差 异 表 达 基 因(differentially expressed genes,DEGs)
10、,进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析12,构建蛋白-蛋白 互 作(protein-protein interaction,PPI)网 络,筛选 hub 基 因 以 及 预 测 靶 向 药 物 分 子,识别Cr()致肝脏损伤的相关基因,为进一步探讨Cr()致机体肝脏损伤的作用机制提供基础。1 材料与方法 1.1数据收集和标准化数据收集和标准化使用的分析数据来自GEO 数 据 库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据集
11、 GSE6519813,种属为大鼠。数据集453第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报(医学版)GSE65198 共 有 59 例 样 本,该 原 始 数 据 已 通 过Partek GS 6.6 中的主成分分析检查了微阵列数据是 否 存 在 异 常,并 采 用 Robust Multi-Array Averaging 算法进行了背景调整、规范化和总结。选择其中20例样本分为2组,第 1 组肝脏 20 mg kg1 Cr()1次暴露后 1 d和对照样本各 5例,第 2组肝脏 20 mg kg1 Cr()1 次暴露后 7 d 与对照样本各 5例。1.2DEGs 的识别和分析的
12、识别和分析将每组中的对照样本作为阴性对照组,暴露样本为实验组,采用 R语言(version 4.0.2)中 的 limma 包(version 3.44.3)进行差异分析,贝叶斯方法建立线性模型,采用t 检验和方差分析进行统计学分析,以 P1且 P0.05。再 利 用 R 语 言 的 pheatmap(version 1.0.12)和 ggplot2(version 3.3.2)包分析 DEGs并可视化,绘制热图和火山图。1.3富集分析富集分析将获得的暴露后 1 d 组和 7 d 组的DEGs 上 传 至 DAVID 2021(https:/david.ncifcrf.gov/home.jsp
13、)进行 GO 富集分析和 KEGG信号通路富集分析。Fisher 精 确 概 率 法 检 验 得 出P值,以 P0.05为差异有统计学意义。1.4PPI 网络构建和网络构建和 hub 基因筛选基因筛选在 STRING 11.5(https:/cn.string-db.org/)14中分别构建暴露后 1 d组、7 d组和暴露后 1 d组及 7 d组均表达的 DEGs 的 PPI 网络图,设置置信度为 0.400 进行筛 选,以 P1 且P0.05)。图 1 A 和 1B 分别为 1 次暴露后 1 d 组和1次暴露后 7 d组 DEGs的热图,图 1C 和 1D 分别是1 次暴露后 1 d 组和
14、1 次暴露后 7 d 组 DEGs 的火山图。其中天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS)、细胞周期蛋白 B2(cyclin B2,CCNB2)、细胞分裂周期 20(cell division cycle 20,CDC20)、细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 抑 制 剂 3(cyclin dependent kinase inhibitor 3,CDKN3)、CXC 基序趋 化 因 子 配 体(C-X-Cmotif chemokine ligand 1,CXCL1)、脂 肪 酸 结 合 蛋 白 4(fatty acid binding protein 4
15、,FABP4)、动 粒 定 位 Astrin 结 合 蛋 白(kinetochore localized Astrin binding protein,KNSTRN)、LOC100912602、金 属 硫 蛋 白 2A(metallothionein 2A,MT2A)、PQ 循环重复包含蛋 白 3(PQ cycle repeats contain protein 3,PQLC3)、RT1 Ib 类 基因座 EC2(RT1-EC2)和生长抑素受体 3(somatostatin receptor 3,SSTR3)是 2 组中均存在 DEGs,共同影响糖皮质激素反应的生物学过程,均参与了卵母细胞减数
16、分裂和细胞周期的信号通路。2.2GO 富集分析和富集分析和 KEGG 通路分析通路分析对 DEGs进行 GO 富集分析,GO 包括生物过程、分子功能和细胞成分3个注释内容。Cr()1次暴露后1 d组DEGs最显著的生物学过程包括药品反应、异种生物刺激反应和衰老等;Cr()1 次暴露后 7 d 组最显著的生物学过程包括有丝细胞分裂、有丝分裂纺 锤 体 中 间 区 组 合 和 细 胞 分 裂 的 正 向 调 节 等。KEGG 通路分析结果显示:Cr()1次暴露后1 d组DEGs 参与了代谢、真核生物中的核糖体生物发生、细胞色素 P450 对异生素的代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及过氧化物酶体增殖
17、物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)信号通路等信号通路;Cr()1 次暴露后 7 d 组DEGs参与了孕酮介导的卵母细胞成熟、细胞周期调节、细胞衰老、卵母细胞减数分裂和 p53信号通路等信号通路。2.3 PPI 网 络 构 建 和网 络 构 建 和 hub 基 因 筛 选基 因 筛 选 基 于STRING 数据库分析 DEGs的 PPI关系,得到暴露后 1 d组共包含 276个节点和 2 470条关系,暴露后7 d组共包含43个节点和532条关系,见图2A和2B。454王睿,等.六价铬致肝脏损伤作用机制的生物信息学分析通过
18、 Cytoscape 中 的 Cytohubba 插 件 进 行 拓 扑 学分 析 筛 选 hub 基 因,按照 degree值排序,暴 露 后1 d 组 degree 值前 5 位的 hub 基因分别为 EBNA1 结合蛋白 2(EBNA1 binding protein 2,EBNA1BP2)、核仁蛋白 58(nucleolar protein 58,NOP58)、鸟嘌 呤 核 苷 酸 结 合 蛋 白 样 3(guanine nucleotide binding protein like 3,GNL3)、核 仁 蛋 白 56(nucleolar protein 56,NOP56)和 WD
19、重 复 域 12(WD repeat domain 12,WDR12),暴露后 7 d 组degree值前 5位的 hub基因分别为 CCNB2、细胞周期蛋白 A2(cyclin A2,CCNA2)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶 1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和驱动蛋白 家 族 成 员 20B(kinesin family member 20B,KIF20B),其 PPI 网 络 见 图 2 C 和 2D。ASNS、CCNB2、CDC20、CDKN3、CXCL1、FABP4、KNSTRN、LOC100912602
20、、MT2A、PQLC3、RT1-EC2 和 SSTR3 是暴露后 1 d 组和 7 d 组中均存在的 DEGs。通过 String 分析 PPI 网络关系,其中CDC20、KNSTRN、CDKN3 和 CCNB2(在 PPI网络中标识符:ENSRNOP00000017117)在网络中心有多个连接节点,包含 4 个节点和 6 条边。导入 Cytoscape软件对 PPI网络图可视化,见图 2 E。2.4预测与预测与 DEGs 相关的靶向药物相关的靶向药物通过 Enrichr平台分析,根据调整 P 值预测,与已被筛选出的hub基因和 1 d及 7 d均表达的 DEGs相关的前 10种潜在靶向药物见
21、表 1。3 讨 论 作为被公认的人类致癌物,Cr()对机体产生损害毒性效应是一个非常复杂的过程。本研究共筛选出 403个 DEGs,其中 20 mg kg1 Cr()肝脏暴露后 1 d 在 实 验 组 和 对 照 组 之 间 共 识 别 出342个 DEGs,20 mg kg1 Cr()肝脏暴露后 7 d共识别出 61 个 DEGs。对 DEGs 构建的 PPI 网络分析后,EBNA1BP2、NOP58 和 GNL3 等基因被筛A,C:1 d after single exposure to Cr()group;B,D:7 d after single exposure to Cr()grou
22、p.图图 1Cr()1次暴露后次暴露后 1 d组和组和 7 d组组 DEGs的热图的热图(A,B)和火山图和火山图(C,D)Fig.1Cluster heatmaps(A,B)and volcanic maps(C,D)of DEGs in 1 d and 7 d after single exposure to Cr()groups455第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报(医学版)选为 20 mg kg1 Cr()肝脏暴露后 1 d 肝脏的hub基因,CCNB2、CCNA2和 CCNB1等基因被筛选为 20 mg kg1 Cr()肝脏暴露后 7 d 的 hub 基因。
23、而 20 mg kg1 Cr()肝脏暴露 7 d后均表达A,B:PPI network diagrams;C,D:Interaction of hub genes;E:Interaction of DEGs existed in 1 d and 7 d after single exposure to Cr()groups.A,C:1 d after single exposure to Cr()group;B,D:7 d after single exposure to Cr()group.图图 2Cr()1次暴露后次暴露后 1 d和和 7 d组组 DEGs及及 hub基因的基因的 PPI网
24、络图网络图Fig.2PPI network diagram of DEGs and hub genes in 1 d and 7 d after single exposure to Cr()groups表表 1与已被筛选出的与已被筛选出的 13个个 Cr()致肝脏损伤致肝脏损伤 DEGs相关的前相关的前 10种潜在靶向药物种潜在靶向药物TabTab.1 1Top Top 1010 potential target drugs related to thirteen selected DEGs of liver injury induced by Cr potential target dru
25、gs related to thirteen selected DEGs of liver injury induced by Cr()TermLUCANTHONE CTD 000062271h-pyrazolo(3,4-d)pyrimidine CTD 000007422H-1-Benzopyran-2-one,7-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)oxy-CTD 00003446CUPRIC OXIDE CTD 00001471Testosterone CTD 000068440173570-0000 PC3 DOWNHydrogen peroxide CTD 00
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