Sirt1促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制.pdf
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1、876安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)网络出版时间:2023-04-21 10:23:01 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1342.029.h t ml口腔医学研究Sirtl促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制孔祥伟,尹伟,王晨辰,张林,程义成摘要 目的 探讨去乙酰化酶1(Sir t l)对炎症牙周膜干细 胞(P DLSCs)成骨分化的作用,并研究其可能的分子机制。方法 分离、培养正常及炎症P
2、DUCs,观察Sir t l在两种细 胞中的表达;将炎症P DUCs进行成骨诱导,同时使用Sir t l 激动剂白芦藜醇上调炎症P DUCs中的Sir t l,观察炎症 P DLSCs的成骨分化情况,West er n bl o t检测Ru n x 2、乙酰化 NF-kB、乙酰化Fo x Ol和Fo x Ol的表达。结果 炎症P DUCs 中Sir t l的表达较正常P DUCs减少(P 0.01);白芦藜醇可 上调炎症P DLSCs中Sir t l的表达;与成骨诱导组比较,成骨 诱导+白芦藜醇组炎症P DLSCs中BSP(f=14.045,P 0.01)、Ru n x 2(t=3.349,P
3、 0.01),OCN(t=7.218,P 0.01)和 Osx(=4.544,P 0.01)mRNA 的表达增加,ALP 染色增强(P 0.01);炎症P DLSCs成骨诱导后Fo x Ol(t=&737,P 0.01)和 Ru n x 2(i=6.152,P 0.01)的表达增强;使用白芦藜醇上调Sir t l的表达后,Fo x Ol(t=5.912,P 0.01)和Ru n x 2(t=6.277,P 0.01)的表达较成骨诱导组进 一步增加,而乙酰化NF-kB(F=184.033,P 0.01)和乙酰 化Fo x Ol(F=301.454,P 0.01)的表达较对照组和成骨诱 导组明显降
4、低。结论 去乙酰化酶Sir t l可以通过去乙酰化 NF-kB和Fo x Ol,从而促进炎症P DLSCs的成骨分化。关键词 去乙酰化酶Sir t l;炎症牙周膜干细胞;成骨分化 中图分类号 R 781.4+2文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0876-05 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.030牙周膜干细胞(per io d o n t a l l ig a men t st em c el l s,P DLSCs)在牙周组织再生修复中发挥重要作用。然而,炎症P DLSCs的再生功能受损,给牙周炎患者
5、使用自体P DLSCs治疗带来困难2-3o细菌感染和 慢性炎症会导致细胞发生表观遗传修饰的改变,从 而导致再生能力的下降。去乙酰化酶1(Sir t u in 1,Sir t l)在多细胞有机体中广泛存在,通过将组蛋白去 乙酰化,参与多种生命过程。Sir t l也是骨密度的2022-12-09 接收基金项目:国家自然科学基金(编号:81901046);江苏省自然科学基 金(编号:BK20170115)作者单位:东部战区总医院口腔科,南京210002作者简介:孔祥伟,女,主治医师;程义成,男,副主任医师,责任作者,E-ma il:c h en g y-ic h en g 0220 163.c o
6、m重要调节因子。但Sir t l对炎症P DLSCs成骨分 化的影响及其机制尚未见相关研究报道。该研究在 炎症P DLSCs成骨诱导过程中使用Sir t l激动剂白芦 藜醇上调细胞中的Sir t l,观察Sir t l对炎症P DLSCs 成骨分化的影响;同时,检测叉头框蛋白0(f o r k h ea d bo x 0 pr o t ein,Fo x O)和核内转录调节因子kB(n u c l ea r f a c t o r-Kb,NF-kB)的表达,明确Sir t l调控炎症 P DLSCs的分子机制可以为恢复疾病状态下干细胞 的再生能力提供理论依据。1材料与方法11主要试剂与仪器DME
7、M培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、P BS(美国Gibc o公司);I型胶原 酶、胰蛋白酶、甘油磷酸钠、地塞米松、LP S(美国 Sig ma公司);白芦藜醇(美国Sel l ec k c h emic a l s公 司);谷氨酰胺、TRIzo l Rea g en t(美国 In v it r o g en 公 司);BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒、RIP A细胞 裂解液.Br a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天 生物技术有限公司);逆转录试剂盒、实时荧光定量 P CR试剂盒(日本Ta k a r a公司);Sir t l抗体、Ru n x 2 抗体(美国Cel l
8、 Sig n a l in g公司);乙酰化NF-kB抗 体、乙酰化Fo x Ol抗体、Fo x Ol抗体(美国Abea m公 司);3-a c t in抗体(江苏康为世纪生物技术有限公 司);ECL发光试剂盒(美国P ier c e公司);7500型快 速实时荧光定量P CR仪(德国Appl ied Bio sy st ems公 司);倒置相差显微镜(日本Ol y mpu s公司);JS-860A自动凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)。1.2正常与炎症PDLSCs的分离和培养正常 P DLSCs来自于健康个体,年龄20-35(2&00 3.53)岁;炎症P DLSCs来自于慢性牙周炎患者,年
9、 龄31-40(35.00 4.27)岁。两种组织均来自于因 正畸需要而拔除的、无嶠坏的前磨牙。用无菌手术 刀片刮取牙齿根中1/3的牙周膜组织,接种至6孔 板内,每隔3 d更换培养液,直至有细胞从组织块边 缘爬出。细胞生长达80%汇合时胰酶消化传代。取第3 5代细胞用于本实验研究。13成骨诱导分化 取炎症P DLSCs制备细胞悬 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)877液,以2 x IO。/孔的密度接种于6孔板中,在细胞达 到70%汇合后,将培养液更换为成骨诱导液(含5%胎牛血清的DMEM,地塞米松0.1
10、mo l/L,p-甘油磷 酸钠 0.01 mo l/L,维生素 C 5 X10-5 mo l/L),每隔 3 d换液。倒置相差显微镜下观察,细胞呈复层生长 并出现圆形结节。实验分为4组,对照组:炎症 P DLSCs;白芦藜醇组:炎症P DLSCs+白芦藜醇;成骨诱导组:炎症P DLSCs+成骨诱导;成骨诱 导+白芦藜醇组:炎症P DLSCs+成骨诱导+白芦藜 醇。1.4 ALP染色 吸弃培养液,P BS洗涤,4%多聚 甲醛固定1 h,P BS洗涤后,每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液,室温避光放置30 min,吸弃工作液,P BS洗涤,显微镜下拍照。1.5 实时定量PCR检测收集培养的炎
11、症 P DLSCs,加入TRIzo l Rea g en t裂解细胞,提取总 RNA。反转录操作步骤按照反转录试剂盒的说明书 进行。进行反转录反应后,将得到的c DNA模板按 照 SYBR P r emix Ex Ta q TM II(Ta Ka Ra Co d e:DRR081)操作说明书加入检测体系,使用ABI 7500 实时定量仪进行Rea l-t ime P CR反应。检测ALP、Ru n x 2、OCN和Osx的表达,p-a c t in为内参。弓|物序 列由上海生物工程公司设计合成,见表1。表1引物序列基因引物序列ALPF:5 l GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3R:
12、5-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3Ru n x 2F:5 LCCCGTGGCCTTCAAGGT-3R:5-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3OCNF:5-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3 R:5 t GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3OsxF:5 z-CCAGAAGAACTGGTAGATCAGCAA-3R:5-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3Sir t lF:5=CCCAGAACATAGACACGCTGGA3R:5-ATCAGCTGGGCACCTAGGACA-3p-a c t inF:5 l TGGCACCCAGCACAATGA
13、A-3R:5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-31.6 Western blot检测 使用RIP A裂解液提取细 胞蛋白。使用Br a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒测定蛋 白浓度。按照4:1的比例加入5 X l o a d in g bu f f er,100 C a5 min水煮变性。将蛋白样本用1 X l o a d in g bu f f er调整到同一体积。进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳,电泳停止后切胶、转膜。5%牛血清白蛋白室温 封闭2 h。封一抗,4弋过夜。复温1 h后洗膜液冲 洗3次,放入二抗,室温孵育l h。ECL发光液A:B=1:1混合,注意避光,均匀滴
14、加在膜上,放入JS-860A自动凝胶成像仪曝光。用Qu a n t it y On e软件分 析各条带的灰度值,以3-a c t in为参照,计算相对灰 度值。1.7统计学处理 采用SP SS 20.0统计软件进行 数据分析,以上实验均重复3次,实验数据均以x s 表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因 素方差分析。P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Sirtl在正常PDLSCs和炎症PDLSCs中的表 达通过有限稀释法获取人正常和炎症组织来源的 P DLSCs,West er n bl o t检测两种P DLSCs中去乙酰化 酶Sir t l的表达情况。West er n
15、 bl o t结果显示,在正 常P DLSCs中Sir t l的蛋白表达水平较高,而在炎症 P DLSCs中Sir t l的表达受到抑制,差异有统计学意 义(t=5.237,P 0.01)。见图 1。a b图 1 Western blot 检测 Sirtl在正常PDLSCs和炎症PDLSCs中的表达a:正常 P DLSCs;b:炎症P DLSCs;与正常 P DLSCs 比较:*P 0.012.2白芦藜醇对炎症PDLSCs成骨分化的影响 在培养的炎症P DLSCs中加入Sir t l激动剂白芦藜 醇,实时定量P CR和West er n bl o t检测Sir t l的表达。结果表明,白芦藜醇
16、可增加炎症P DLSCs中Sir t l的 表达。将炎症P DLSCs进行成骨诱导,同时使用白 芦藜醇上调炎症P DLSCs中的Sir t l,诱导3 d后实时 定量 P CR 检测 BSP、Ru n x 2、0CN 和 Osx mRNA 的表 达,诱导7d后进行ALP染色。实时定量P CR结果 显示,与成骨诱导组比较,在成骨诱导时加入白芦藜 醇可增加 BSP(t=14.045,P 0.01)、Ru n x 2(t=3.349,P 0.01)、OCN(t=7.218,P 0.01)和 Osx(i=4.544,P 0.01)mRNA 的表达。ALP 染色结果 表明,成骨诱导+白芦藜醇组的ALP染
17、色较成骨诱 导组增强(t=l l.513,P 0.01),说明白芦藜醇可增 强炎症P DLSCs的成骨分化。见图2、表2。878 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)A 5Ba bD*Me!VNamds0*glvNHmzxunM*#8If*炊wglvNMHI xso图2实时定量PCR和Western blot检测白芦藜醇对炎症PDLSCs中Sirtl表达的影响A:实时定量P CR检测Sir t l mRNA的表达;B:West em bl o t检测Sir t l的表达;C:ALP染色(Ba r=100|x
18、m);D:实时定量P CR检测BSP、Ru n x 2、0CN和Osx mRNA的表达;a:对照组;b:白芦藜醇组;c:成骨诱导组;d:成骨诱导+白芦藜醇组;与对照组比较:*P 0.05;与成骨诱导 组比较:*P 0.05表2 实时定量PCR检测BSP、Runx2、OCN和Osx mRNA相对表达量G s)组别BSPRu n x 2OCNOsx对照0.880 7 0.806 80.956 7 0.112 50.960 7 0.283 30.879 6 0.458 7成骨诱导2.651 0 1.367 3*2.080 0 0.826 6*1.810 0 0.592 5*3.135 0 0.876
19、 6*成骨诱导+白芦藜醇9.980 01.645 7,*#3.926 7 0.735 0*4.876 7 1.949 3*8.172 3 2.030 3*与对照组比较:*P 0.05;与成骨诱导组比较:*P 0.012.3 Sirtl对炎症PDLSCs成骨诱导过程中FoxOl 和NF-kB表达的影响 将炎症P DLSCs进行成骨 诱导,同时使用白芦藜醇上调炎症P DLSCs中的 Sir t l,成骨诱导7 d,West er n bl o t检测Sir t l、乙酰化 NF-kB、乙酰化Fo x Ol,Fo x Ol和Ru n x 2的表达。结 果显示:与对照组比较,炎症P DLSCs成骨诱导
20、后 Fo x Ol(t=&737,P 0.01)和 Ru n x 2(i=6.152,P 0.01)的表达增强;在成骨诱导+白芦藜醇组中,炎 症 P DLSCs 中 Sir t l(F=71.260,P 0.01)的表达较 对照组和成骨诱导组上调,同时Fo x Ol(i=5.912,P 0.01)和 Ru n x 2(t=6.277,P 0.01)的表达较成 骨诱导组进一步增加,而乙酰化NF-kB(F=184.033,P 0.01)和乙酰化 Fo x Ol(F=301.454,P 0.01)的表达较对照组和成骨诱导组明显降低。见图3。3讨论表观遗传学是指在基因的核昔酸序列不发生改 变的情况下,
21、由于体内、外环境因素的影响,基因表 达了可遗传的变化。近年来研究发现,人体多种 疾病的发生、发展都与表观遗传密切相关。类风湿 关节炎患者的间充质干细胞表现出较低的增殖能 力,并且数量会随着年龄的增加而减少。系统性 红斑狼疮患者的骨髓间充质干细胞则表现出成骨能 力的下降。课题组在前期的实验中观察到炎 症P DLSCs在脱离炎症环境后,经过长期的体外培 养和传代,仍然存在成骨功能的缺陷,这可能是由于 在长期的慢性炎症微环境中P DUCs发生了表观遗 传的改变。表观遗传现象包括DNA甲基化,组蛋白甲基 化、乙酰化和泛素化等。其中,组蛋白乙酰化作用主 要由两种功能相反的酶组蛋白乙酰转移酶(h ist
22、o n e a c et y l t r a n sf er a ses,HATs)和组蛋白去乙酰化 酶(h ist o n e d ea c et y l a ses,HDACs)来完成o HATs 通 过对组蛋白产生乙酰化作用,导致特定位点的染色 质解螺旋,从而起到转录活化的作用;而HDACs可安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)879a bUHOe,巴=.fclso ob b5 4 3 2 15 4 3 2 1 启 i i、IOXOBIOXOB*#*a b co o.5.0.5.5.0.51 1-o1
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