μ阿片受体在大鼠结肠平滑肌细胞中的表达.pdf
《μ阿片受体在大鼠结肠平滑肌细胞中的表达.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《μ阿片受体在大鼠结肠平滑肌细胞中的表达.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、772安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)网络出版时间:2023-04-21 14:11:11 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.012.h t ml从阿片受体在大鼠结肠平滑肌细胞中的表达任晓淳,贾冰涵I,李金钊I,罗慧娟I,李 愛,李军平I摘要 目的 通过培养大鼠结肠原代平滑肌细胞,探索 阿片受体(MOR)在结肠平滑肌细胞中的表达特性。方法 分离、培养和鉴定结肠平滑肌细胞;运用免疫荧光组织
2、化学 双重标记法观察MOR、内吗啡肽2(EM2)、钙调蛋白(Ca M)在结肠平滑肌细胞的分布特性;施加乙酰胆碱(ACh)(l x 10_3 mo l/L)或 EM2(2|j,mo l/L)后,West er n bl o t 技术检测 Ca M蛋白表达变化;单独或依次施加ACh(l X 10 3 mo l/L)和EM2(2|x mo l/L)后,钙离子成像法观察平滑肌细胞内钙 离子浓度的变化。结果 鉴定结肠平滑肌细胞:a-肌动蛋白(a-SMA)标记的阳性细胞占细胞总数的95%以上;免疫荧 光组织化学双重标记显示,在结肠平滑肌细胞有M0R和 EM2的分布,且所有MOR和EM2阳性细胞均与a-SM
3、A有 共存;West er n bl o t检测发现,施加ACh 10 min后,Ca M表达 升高(P 0.05);施加EM2 10 min后,Ca M表达降低(P 0.05);钙离子成像结果显示,单独施加ACh,平滑肌细胞内 钙离子浓度明显升高(P 0.05);单独施加EM2,结肠平滑 肌细胞内钙离子浓度下调(P 0.05),依次施加ACh和EM2 后,EM2显著抑制了 ACh诱发的钙离子浓度升高(P 105个/ml密度接种于24孔细胞培养板,待细胞长到致密 单层后进行HE染色。弃掉原培养基,用P BS(4 弋)洗3次,每次5 mino加4%多聚甲醛500 室 温下固定30 min后,移出
4、细胞间,用P BS(4七)洗3 次。加入不同浓度梯度乙醇,无水乙醇I 5 min,无 水乙醇 U 5 min,95%乙醇 5 min,90%乙醇 5 min,80%乙醇5 min,70%乙醇5 min,流水冲洗2 min0 苏木精染色5 min,在流水下冲洗5 min,转移到盐酸 乙醇中分化3 s,继续流水冲洗15 min,用伊红染色5 mino脱水:70%乙醇3 s,80%乙醇3 s,90%乙醇3 s,95%乙醇5 min,无水100%乙醇I 5 min,无水 100%乙醇U 5 mino透明:分别加入1 ml二甲苯I 和二甲苯U各5 min,用中性树脂封片后在普通光镜 下观察。1.2.3免
5、疫荧光组织化学双重标记取第2次传 代细胞,按照1 x 105个/ml密度接种于24孔细胞培 养板,细胞在载玻片上生长融合到95%以上进行实 验。弃掉原培养基,用P BS(4咒)洗3次,每孔加入 500|114%多聚甲醛,室温下固定30 min0用P BS(4 玄)洗3次,每个孔内加入100 pil 0.5%Tr it o n X-100 孵育10 min,P BS洗3次,每次10 min。用5%羊血 清封闭30 min后,分别加入对应的一抗:兔抗M0R 多克隆抗体(1:200)和小鼠抗a-SMA单克隆抗体(1:200)、兔抗EM2多克隆抗体(1:100)和小鼠 抗a-SMA单克隆抗体(1:20
6、0)、兔抗Ca M单克隆 抗体(1:200)和豚鼠抗M0R多克隆抗体(1:200),室温孵育1 h后,置于4咒孵育48 h0复 温20 min后,用P BS(4%)洗3次,每次10 min,分 别加入荧光素标记的二抗:Al ex 594标记山羊抗兔 血清(1:200)和Al ex 488标记山羊抗鼠血清(1:200)、Al ex 594标记山羊抗豚鼠血清(1:200)和Al ex 488标记山羊抗兔血清(1:200)o室温孵育 1 h后,用P BS(4七)洗3次,每次10 min,用DAP I 染核封片,5 min后用荧光显微镜观察并采集图片。1.2.4 West er n bl o t检测
7、取第2次传代的大鼠结 肠平滑肌细胞,弃掉培养基,用P BS清洗细胞3次,774安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)施加干预措施,将结肠平滑肌细胞分为三组,正常对 照组(CON)、乙酰胆碱组(ACh,浓度1 x 10 7 mo l/L)、内吗啡肽-2组(EM2,浓度2|imo l/L),分别孵育 结肠平滑肌细胞1、5、10、15 min后提取蛋白。按 Ly sis bu f f er 1 ml,磷酸酶抑制剂10丛1,蛋白酶抑制 剂1|x l,P MSF 5讪配置细胞裂解液,摇匀置于冰面 上,用无菌细胞刮将细胞推
8、向培养瓶的一侧,于冰上 裂解30 min。不断摇晃培养瓶使细胞充分裂解,将 细胞碎片和裂解液移置1.5 ml离心管内,于4兀下 12 000 r/min离心5 min0将离心后的上清转移到 0.5 ml离心管中于一 80弋保存。用二座咻甲酸(BCA)法测量蛋白质浓度,分别取样品蛋白、纯水 和5 X蛋白上样缓冲液(5 X l o a d in g bu f f er)配平,分 装保存于-80 V,避免反复冻融。各样品蛋白取30 jig上样,80 V电压电泳30 min后,切换至120 V电 压继续进行,200 mA恒流湿转,MOR蛋白(60 min)、EM2 蛋白(20 min)、Ca M(30
9、 min)、GAP DH(40 min)分别转印到P VDF膜上。5%的脱脂牛奶 室温封闭2 h后,将含有EM2蛋白、MOR蛋白、Ca M 蛋白、GAP DH蛋白的P VDF膜浸入到对应的兔抗 EM2单克隆抗体(1:1 000)、兔抗MOR多克隆抗 体(1:1 000)、兔抗Ca M单克隆抗体(1:1 000)和 小鼠抗GAP DH单克隆抗体(1:2 000),室温孵育1 h后置于4七过夜。用含0.1%吐温20的Tr is缓冲 盐溶液(t r is bu f f er ed sa l in e w it h t w een 20,TBST)洗膜 3次,每次10 mino加对应的HRP-山羊抗兔
10、Ig G(1:3 000)和 HRP-山羊抗小鼠 Ig G(l:3 000)室 温孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,超灵敏化 学发光试剂使蛋白条带可视化,通过化学图像系统(Amer sh a m Ia mg e 600)曝光采集图像。1.2.5钙离子成像检测 取第2次传代的大鼠结 肠平滑肌细胞,弃去培养液,用HBSS液(不含钙镁,不含酚红)冲洗细胞3次,加入钙离子荧光探针 Fl u o 4,AM 1|x l,pl u r o n ic F-127 1 pl,在 37 七的培 养箱中孵育30 min后,在荧光显微镜下观察负载情 况。将孵育的细胞置于显微镜下,打开加药通道,第 一通道
11、加入5 ml ACh(l X 10-3mo l/L),第二通道加 入5 ml EM2(2 jimo l/L),第三通道先加入5 ml ACh(1 x 10 7mo l/L)观察 200 s 后接着加入 5 ml EM2(2 p-mo l/L),打开氮气阀门,排空管内空气,选择中等 密度的细胞层,在激光显微镜下进行持续动态扫描,钙离子与Fl u o A,AM结合在488 n m的波长和526 n m的发射波长处被激发,通过计算机记录钙离子荧 光强度的变化。实验结果以给药前后单个细胞的荧 光强度变化表示细胞内游离钙离子浓度的相对变 化,实验结果用厶F/F。表示,F=F-F,F:钙离子 荧光强度值;
12、F。:基线水平。1.3统计学处理 采用SP SS 22.0软件进行数据 分析,West er n bl o t实验结果使用单因素方差分析,钙成像结果使用配对样本t检验,P 0.05)o 施加 ACh(l x l O-3 mo l/L)或 EM2(2 jjimo l/L)10 min时,与CON组比较,ACh组Ca M蛋白表达 升高(P=0.037 2),但EM2组Ca M蛋白表达下降(P=0.018 4),见图 7。2.7施加不同干预措施后,平滑肌细胞内钙离子浓 度的变化 施加ACh(l Xl O3 mo l/L),与给药前(Ba s e)比较,400 s后平滑肌细胞内钙离子荧光强度 增强(t
13、=3.101,P=0.021 1),700 s时达到高峰(图 8A、B)。施加 EM2(2 pu mo l/L)后,与给药前(Ba se)比较,400 s后平滑肌细胞内钙离子荧光强度降低Q=2.187,P=0.030 5,图 8C、D)。施加 ACh(l x 10 mo l/L)后,与给药前(Ba s e)比较,平滑肌细胞 内钙离子荧光强度增强(P=0.028 6),观察200 s 后接着施加EM2(2 jx mo l/L),与单纯施加ACh(l x IO mo l/L)比较,平滑肌细胞内钙离子荧光强度下 降(F=24.20,P=0.000 2,图 8E、F)。3讨论原代结肠平滑肌细胞是从大鼠
14、远端结肠组织提 取和分离后获得的,遗传特征与体内细胞非常相似,适合于细胞形态、功能和分化方面的研究,排除了机 776 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)ABDE 亠%*、t?*GH.图3大鼠结肠平滑肌细胞HE染色A C:培养24 h的结肠平滑肌细胞;D F:培养7 d的结肠平滑肌细胞;GI:培养14 d的结肠平滑肌细胞;A、D、G:x 4;B、E、H:x l O;C、F、I:x 20图4免疫荧光组织化学双重标记x 20A:MOR阳性标记的平滑肌细胞;B:a-SMA阳性标记的平滑肌细胞;C:DAP I标记的细
15、胞核;D:MOR和a-SMA阳性标记物在平滑肌细胞中 的共表达;E:EM2阳性标记的平滑肌细胞;F:a-SMA阳性标记的平滑肌细胞;G:DAP I标记的细胞核;H:EM2和a-SMA阳性标记物在平滑肌 细胞中的共表达;箭头代表免疫荧光标记的阳性细胞A:MOR阳性标记物在结肠平滑肌细胞中的表达;B:Ca M阳性标记物在结肠平滑肌细胞中的表达;C:DAP I标记的细胞核;D:MOR和Ca M 阳性标记物在平滑肌细胞中的共表达;箭头代表免疫荧光标记的阳性细胞安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)777Ak u737k
16、 u5537图6 6 Western blot技术检测EM2和MOR在结肠平滑肌细胞的表达A:EM2在结肠平滑肌细胞中的蛋白表达;B:M0R在结肠平滑 肌细胞中的蛋白表达体内其他因素的干扰。a.SMA存在于胃肠道肌 层等各种肌组织内,构成了平滑肌细胞的骨架,参与 平滑肌细胞许多重要的功能活动,包括平滑肌细胞 的舒缩活动。因此,本研究通过标记a-SMA用于 鉴定结肠平滑肌细胞是可行的。课题组前期研究发现,EM2在结肠神经细胞 也有大量分布。然而,M0R和EM2在结肠平滑肌 细胞的分布未见文献报道。本研究免疫荧光组织化 学结果显示,在原代培养的平滑肌细胞内有M0R 和EM2的分布,且M0R与Ca
17、M在培养的平滑肌细 胞内也有共存。Ca M是平滑肌细胞内的钙离子受体蛋白,其本 身没有活性,但对钙离子有高度依赖性。钙离子与 Ca M结合形成Ca2+-Ca M复合物,Ca2+-Ca M复合物 是一种重要的兴奋-收缩耦合调节因子问,通过平 滑肌细胞内信号传导通路,调控平滑肌收缩和舒 张M,当胞内钙离子浓度升高时,钙离子与Ca M形 成的Ca2+-Ca M复合物作用于胞质中的肌球蛋白轻 链激酶,使肌球蛋白轻链激酶活化,从而触发平滑肌 收缩。因此,Ca M在钙离子依赖性信号转导过程中 起到关键作用问。本研究结果显示,在施加干预措 施ACh或EM2大约10 min后平滑肌细胞反应明 显。施加ACh后
18、平滑肌细胞内的Ca M表达增加,但 是施加EM2后Ca M的表达下降。有文献报道,EM2和吗啡在缓解癌性痛方面,其止痛时效完全不 同,吗啡起效时间大约在40 100 min,而EM2的镇 痛作用起效快、时间短,在10 min时药效最强,这与 本研究结果相似。Ca M的活性高度依赖平滑肌细 胞内钙离子的浓度。说明EM2经M0R介导后可能 对钙离子的释放有抑制作用。有文献报道,平滑肌细胞的收缩活动主要受 胞质内钙离子的调控。而胃肠道平滑肌的舒缩主要 与钙离子依赖途径相关。在钙离子依赖途径中胞内 钙离子来源主要有两方面:外钙内流和内钙池释放。外钙内流是通过电压依赖型和受体依赖型等膜通 道,引起细胞外
19、钙离子进入细胞内。内钙池释放 是指肌浆网中钙离子通过释放和再摄取对胞内钙离 子浓度进行调节3。ACh可通过平滑肌细胞表面 的毒蕈碱受体M3介导,激活平滑肌细胞膜电压依 赖性钙通道和受体操纵性钙通道,促使钙离子内流,同时也可通过耦联细胞膜上的G蛋白,激活磷脂酶 C,该酶可水解4,5-二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸 肌醇和二酰甘油,三磷酸肌醇作为第二信使,作用于 肌浆网膜上的三磷酸肌醇受体,导致肌浆网储存的 钙离子释放,使细胞内钙离子浓度短暂升高,Ca2+-D 15 minCON组ACh组EM2组 Ca M O 15 minH1.5GAP DHC10 minCa MGAP DHB 5 minCON组A
20、Ch组EM2组1.05 minFA 1 minCON组ACh组EM2组.o.5.o.5 Lo.Lo.效來山M M国EoEo,0,01111 旳來BWJWBWJW,5,58 6 4 28 6 4 20.0.ao.0.0.ao.工,0,5,0,51.o.1.o.旳wEfflwEffl為。o 111CON组ACh组EM2组 CON组 ACh组 EM2 组0CON组ACh组EM2组0 11111CON组ACh组EM2组图7 Western blot技术检测不同时间点结肠平滑肌细胞内CaM蛋白的表达A G:分别为干预后1、5、10、15 min Ca M蛋白表达及其定量结果;与CON组比较:*P 0.0
21、5778安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)2.02.0.511o 51.o.150100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000ACh 时间(s)D0.186 56 511 11 a a14Ba se ACh100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000EM2 时间(s)150.2.0.8.6.2.0.8.61 1 o o1 1 o o 廻来牀衩累Ba se ACh100 200 300 400 500 600700 800 900 100
22、0ACh EM2 时间(s)0.4Ba se ACh EM2赳陋来岷衩累0a图8钙成像技术检测平滑肌细胞内钙离子浓度的变化A、B:施加ACh后,平滑肌细胞中钙离子的荧光强度;C、D:施加EM2后,平滑肌细胞中钙离子的荧光强度;E、F:施加ACh后,平滑肌细胞中钙离子的荧光强度;与给药前(Ba se)比较:*P 0.05;与ACh组比较:#P 0.05Ca M复合物增加,激活肌球蛋白轻链激酶,引起胃 肠道平滑肌细胞收缩呦。有文献报道,在体外培养的细胞中通过施加 ACh,在240 s细胞内钙离子浓度达到最大值,在本 研究钙离子成像实验中,为排除细胞外钙内流对平 滑肌细胞功能的影响,特意使用了无钙离
23、子缓冲液。单纯施加ACh后,钙离子浓度在700 s内升高达到 最大值,与文献报道基本一致。但单纯施加EM2 后,钙离子浓度明显下降。施加ACh后观察200 s,接着施加EM2,EM2明显抑制了 ACh的作用。据此 推测,EM2经结肠平滑肌细胞表面的MOR介导后,可能对细胞内肌浆网钙离子的释放有调节作用。综上所述,平滑肌细胞内EM2或肠神经细胞分 泌的EM2,经平滑肌细胞表面的MOR介导后,可能 通过调节胞内肌浆网钙离子释放,反馈性的参与到 平滑肌细胞的收缩抑制过程中,并且此过程也可能 受到肠神经系统的正向调控。对于平滑肌细胞表面 的MOR在平滑肌细胞功能活动中的具体作用机制 和功能,尚需进一步
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 阿片 受体 大鼠 结肠 平滑肌 细胞 中的 表达
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。