布拉氏酵母发酵山药多糖的分离鉴定与体外生物活性探究_刘迎欣.pdf
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1、刘迎欣,伊娟娟,邵怡雯,等.布拉氏酵母发酵山药多糖的分离鉴定与体外生物活性探究 J.食品工业科技,2023,44(14):154162.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100244LIU Yingxin,YI Juanjuan,SHAO Yiwen,et al.Isolation,Identification and Biological Activity of Fermented Chinese YamPolysaccharides by Saccharomyces boulardiiJ.Science and Technology of Food Indu
2、stry,2023,44(14):154162.(in Chinese withEnglish abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100244 生物工程 布拉氏酵母发酵山药多糖的分离鉴定与体外生物活性探究布拉氏酵母发酵山药多糖的分离鉴定与体外生物活性探究刘迎欣1,2,伊娟娟1,2,邵怡雯1,2,崔燕3,李雪1,2,王金柱1,2,郝利民3,*,鲁吉珂1,2,*(1.郑州大学生命科学学院,河南郑州 450001;2.中原食品实验室,郑州大学,河南郑州 450001;3.军事科学院系统工程研究院,北京 100010)摘要:目的:探究通过布拉氏酵母发
3、酵怀山药,来提高发酵怀山药多糖(Fermented Chinese yam polysaccharides,FCYP)的多糖含量以及生物活性。方法:采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法及福林酚法分别检测 FCYP 和未发酵怀山药多糖(Unfermented Chinese yam polysaccharides,UCYP)中多糖、总蛋白和多酚的含量;用高效液相色谱、紫外和红外光谱分析发酵怀山药多糖的单糖组成以及理化性质;对比分析布拉氏酵母发酵前后怀山药多糖的体外抗氧化活性和免疫调节活性。结果:相较于 UCYP(383.0312.57 mg/g),FCYP 中的多糖含量得到显著提高(480.715.9
4、3 mg/g,P0.001);红外光谱分析发现 FCYP 在 3279 和 1636 cm1处具有多糖典型官能团(O-H和 C-O);FCYP 的单糖组成以半乳糖和甘露糖为主,二者质量百分比分别为 48.70%和 16.19%;此外,体外抗氧化实验结果显示,FCYP 在 1.05.0 mg/mL 浓度范围内具有良好的 DPPH 自由基清除能力,并且 FCYP 在 5.0 mg/mL浓度下的还原力显著高于 UCYP(P0.05);免疫调节结果显示,FCYP 的促 RAW264.7 细胞增殖活性和促 NO 产生能力优于 UCYP。结论:布拉氏酵母发酵处理怀山药是一种有效的提高多糖含量与生物活性的方
5、法。本研究可为发酵怀山药多糖天然抗氧化产品的开发提供依据。关键词:布拉氏酵母,山药多糖,理化性质,抗氧化活性,免疫调节活性本文网刊:中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文章编号:10020306(2023)14015409DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100244Isolation,IdentificationandBiologicalActivityofFermentedChineseYamPolysaccharidesbySaccharomycesboulardiiLIUYingxin1,2,YIJuanjuan1,2,SHAOYiwen1,2,
6、CUIYan3,LIXue1,2,WANGJinzhu1,2,HAOLimin3,*,LUJike1,2,*(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2.Food Laboratory of Zhongyuan,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;3.Systems Engineering Institute,Academy of Military Sciences(AMS),Beijing 100010,China)Abstract:Obje
7、ctive:To improve the polysaccharide content and biological activities of the fermented Chinese yampolysaccharides(FCYP)by fermentation with Saccharomyces boulardii.Methods:The contents of polysaccharides,totalprotein and polyphenols of FCYP and unfermented Chinese yam polysaccharides(UCYP)were deter
8、mined by phenol-sulfuric acid method,coomassie bright blue method and folin-ciocalteu method,respectively.The monosaccharide 收稿日期:20221025 基金项目:国家自然基金青年科学基金项目(31900296);郑州大学教授团队助力企业创新驱动发展专项(JSZLQY2022070)。作者简介:刘迎欣(1998)(ORCID:0000000220423647),女,硕士,研究方向:食品生物技术,E-mail:。*通信作者:郝利民(1969)(ORCID:000000033
9、0985149),男,博士,高级工程师,教授,研究方向:食品生物技术与军用功能食品,E-mail:。鲁吉珂(1982)(ORCID:0000000193394835),男,博士,教授,研究方向:食品生物技术,E-mail:。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 composition and physicochemical properties of FCYP and UCYP were determined by ultraviolet spectrum
10、 analysis,highperformance liquid chromatography and Fourier transform infrared spectroscopy.Then the antioxidant activity andimmunomodulatory activity were compared and analyzed.Results:Compared with UCYP (383.0312.57 mg/g),thepolysaccharide content in FCYP was significantly increased(480.715.93 mg/
11、g,P0.001).The Fourier transform infraredspectroscopy analysis showed that FCYP had typical polysaccharide functional groups(O-H and C-O)at 3279 and 1636 cm1,respectively.The monosaccharide composition of FCYP was mainly galactose and mannose,with the mass percentage of48.70%and 16.19%,respectively.I
12、n addition,the results of antioxidant activity in vitro showed that FCYP had the bestDPPH free radical scavenging activity in the concentration range of 1.05.0 mg/mL.And the reducing power of FCYPat 5.0 mg/mL was significantly higher than that of UCYP(P0.05).Finally,the results of immunomodulatory a
13、ctivityshowed that FCYP showed good enhanced cell proliferation activity and promoted NO production in RAW264.7 cells.Conclusion:It was an effective method to improve the polysaccharide content and biological activity of Chinese yam byfermentation with Saccharomyces boulardii.This study would provid
14、e a basis for the development of natural antioxidantproducts of fermented polysaccharides of Chinese yam.Key words:Saccharomyces boulardii;yam polysaccharide;physicochemical property;antioxidant activity;immunore-gulatory activity 怀山药是一种典型的药食同源的天然绿色食品,含有丰富的蛋白质和黏性多糖等活性成分,具有抗氧化、降血脂、提高肠道免疫力等功能1。目前对怀山药的
15、开发利用以及相关研究逐渐增多。多糖是怀山药中主要的活性物质,具有降血糖、抑制肿瘤细胞增长、抗氧化、调节免疫等多种保健作用23。用传统的超声等方法从怀山药实体中提取多糖,提取效率低并且还存在损失率大、成本高昂等缺点。为了提高怀山药多糖得率和活性,利用微生物发酵技术制备多糖成为一种新兴技术应运而生45。前人研究表明经过微生物发酵后可以有效提高多种活性物质释放,如酚类、多糖等,可提高机体抗氧化能力。例如,联合植物乳杆菌 C88 发酵后的人参多糖具有更明显的免疫调节活性以及体外抗氧化活性6;采用灰树花菌发酵米糠粕提取液后,其中多糖总含量降低但对 DPPH 自由基和OH 的清除率显著提高,同时在抗炎和提
16、高免疫力方面均具有良好效果7;另外,Tseng 等8通过红曲霉发酵山药及大米所得的发酵多糖均具有较强的清除自由基等体外抗氧化能力和对 RAW264.7 细胞的良好的免疫调节能力(包括细胞增殖、一氧化氮产生、吞噬和 TNF-等细胞因子的产生)。布拉氏酵母是一种很好的发酵益生菌,生长过程中产生的代谢物不仅可发挥本身的药用价值,又能调节并改善发酵液中的液态环境,充分释放中草药中的有效成分9。目前常用的发酵菌种主要有酵母菌、益生芽孢菌、乳杆菌、双歧杆菌等,鲜有利用布拉氏酵母菌发酵提取多糖的研究。因此,本研究用布拉氏酵母菌对怀山药进行发酵处理,充分释放其中的有效成分,通过水提醇沉法提取发酵怀山药中的多糖
17、组分,并对其单糖组成、分子量以及结构进行鉴定,初步探讨布拉氏酵母发酵怀山药多糖的体外抗氧化和免疫调节活性,为发酵怀山药多糖作为功能食品的开发利用提供参考。1材料与方法 1.1材料与仪器怀山药购买于河南省焦作市温县;布拉氏酵母由天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室提供;RAW264.7 巨噬细胞系购买自中国科学院细胞库;胎牛血清杭州四季青生物有限公司;一氧化氮检测试剂盒、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)上海碧云天生物技术有限公司;DMEM 高糖培养基、中性红、耐高温-淀粉酶(酶活力为 40000 U/g)、淀粉葡萄糖苷酶(酶活力为 104 U/g)北京索莱宝科技有限公司
18、;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(2,2-azino-bis-(3-ethylben-zothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)上海麦克林生化科技有限公司;三氟乙酸分析纯,上海阿拉丁生化科技有限公司;葡萄糖、铁氰化钾分析纯,天津致远化学试剂有限公司;苯酚分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司。PerkinElmer 傅里叶红外光谱仪上海珀金埃尔默仪器有限公司;Agilent1260 高效液相色谱仪美国 Agilent 公司;Model 680
19、酶标仪美国 Bio-Rad公司;YXQ-SG46-280S 高压灭菌锅上海博讯实业有限公司;SHZ-3 水循环真空泵河南省予华仪器有限公司;3111 恒温培养箱美国 Thermo 公司;JW 1016 低速离心机安徽嘉文仪器装备有限公司。1.2实验方法 1.2.1 怀山药的发酵将新鲜怀山药洗净去皮、切片晒干,40 目粉碎过筛,得到样品粉末之后密封保存。取布拉氏酵母菌(甘油冷冻菌种)接种于已灭菌的沙氏培养基中(121,20 min),于 180 r/min 的摇床中 30 培养 12 h。随后按照相同的方法进行二次活化,即得种子液。取活化后酵母菌按照 2%接种量接种到灭菌后山药培养基(山药块茎粉
20、末 4%,蛋白胨 1%,pH5.5)于 180 r/min 的摇床中 30 发酵第 44 卷 第 14 期刘迎欣,等:布拉氏酵母发酵山药多糖的分离鉴定与体外生物活性探究 155 24 h,未发酵对照组按照 0%接种量接种,其他步骤保持一致。将不同条件制备的发酵液冷冻干燥,即得发酵怀山药(Fermented Chinese yam,FCY)和未发酵怀山药(Unfermented Chinese yam,UCY)。1.2.2 UCYP 和 FCYP 的提取制备UCYP 和 FCYP的提取制备以及发酵方法基于已有文献稍作修改1011。分别称取冻干后的 UCY 和 FCY 粉末,按照料液比 1:25
21、g/mL 加入蒸馏水,置于 90 水浴锅中浸提 150 min,随后 4000 r/min 离心 10 min,分离上清和沉淀,沉淀继续按照原比例再次热水浸提和离心,而后合并两次上清液。在 60 下旋转蒸发浓缩 2/3 提取液,随后向其中加入耐高温-淀粉酶液(20 U/mL),混合均匀后,90 水浴反应 90 min,流水冷却至 60,将溶液 pH 调为 4.04.5,而后向溶液中加入淀粉葡萄糖苷酶(11 U/mL),继续混合均匀,于 60 水浴反应 30 min,通过碘-碘化钾试剂确定淀粉完全去除后,于 100 水浴反应 20 min,将酶灭活。灭活后溶液 4000 r/min 离心 10
22、min,取上清液加入 4 倍 95%乙醇,4 放置 12 h 进行醇沉。对醇沉后溶液 4000 r/min 离心 10 min,获得不溶于醇的沉淀即怀山药发酵粗多糖,复溶、透析并冻干,即得发酵怀山药多糖(Fermented Chinese yam poly-saccharides,FCYP)和未发酵怀山药多糖(Unfermen-ted Chinese yam polysaccharides,UCYP)。1.2.3 发酵前后粗多糖的组成分析 1.2.3.1 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量12。以标品葡萄糖的质量浓度为横坐标,使用紫外分光光度计于 490 nm 处检测的溶液吸光值为
23、纵坐标,绘制标准曲线并计算出相应线性方程为 y=12.763x0.0541(R2=0.9993)。多糖含量以每克多糖组分所含有的葡萄糖毫克数表示,实验平行重复三次。1.2.3.2 多酚含量测定采用福林酚法测定样品中的多酚含量13。以标品没食子酸的质量浓度为横坐标,使用紫外分光光度计于 760 nm 处检测的溶液吸光值为纵坐标,绘制标准曲线并计算出线性回归方程:y=29.671x0.0364(R2=0.9967)。多酚含量以每克多糖组分所含有的没食子酸毫克数表示,实验平行重复三次。1.2.3.3 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白含量14。以牛血清标准蛋白浓度为横坐标,于 595 n
24、m 处检测的溶液吸光值为纵坐标,绘制标准曲线并计算出线性回归方程:y=4.9573x+0.0132(R2=0.9974)。蛋白质含量以每克多糖组分所含有的蛋白质毫克数表示,实验平行重复三次。1.2.4 多糖理化性质分析 1.2.4.1 紫外光谱称取冻干的 FCYP 和 UCYP 多糖样品,配制为 0.5 mg/mL 溶液,于 200400 nm 光谱范围内进行紫外扫描,观察多糖溶液的特征吸收峰15。1.2.4.2 红外光谱称取 0.1 g 冻干的 FCYP 和 UCYP多糖样品,使用 PerkinElmer 傅里叶红外光谱仪进行红外波长扫描16,扫描范围为 4504000 cm1。1.2.4.
25、3 单糖组成采用高效液相色谱法(Highperformance liquid chromatography,HPLC)测定多糖样品中的单糖含量17。分别称取鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、核糖(Rib)、甘露糖(Man)、N-乙酰-氨基半乳糖(N-acetyl-Gal)、N-乙酰-氨基葡萄糖(N-acetyl-Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)及岩藻糖(Fuc)标准品溶于超纯水,精确配制混合标品溶液(各标品浓度均为 50 g/mL)。准确吸取 250 L 混合标品溶液于 5 mL EP 管中,依次加入 NaOH 溶
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