基于酵母同源重组的转录因子活性分析_裴浩.pdf
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1、 收稿日期:2022-06-09 基金项目:安徽省自然科学基金(2108085MC72)资助。作者简介:裴 浩,硕士。E-mail:*通信作者:陶 芳,博士,副教授。E-mail: 安徽农业大学学报,2023,50(3):544-549 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.008 网络出版时间:2023-06-26 16:17:55 URL https:/ 基于酵母同源重组的转录因子活性分析 裴 浩,李万通,周逍灵,余 敏,陶 芳*(安徽农业大学生命科学学院,合肥 230036)
2、摘 要:转录因子的转录激活验证是分析其转录活性的有效手段之一。黄曲霉菌 bZIP5 基因广泛参与该菌的生长发育,因此拟进行该转录因子的体外活性检测,以 pGBKT7 为骨架载体,采用酵母同源重组法构建载体,与体外重组酶法进行比较,并考察不同长度同源序列对酵母同源重组法构建载体的影响。结果表明:采用外源重组酶法构建载体 pGBKT7-bZIP5,需要经过片段的体外重组连接、转化大肠杆菌,再提取质粒转化酵母 AH109 进行激活验证;而酵母同源重组法只需将线性化载体和片段一起转化酵母 AH109,载体构建与激活验证同步完成,且 21 30 bp 不同长度的同源序列对酵母同源重组法构建载体没有影响,
3、目的基因 bZIP5 均显示有自激活能力,故基于酵母同源重组的载体构建方法可行。该方法无需提供外源重组酶,为基于酵母的载体构建提供了便捷的途径。关键词:载体构建;同源重组;酵母;bZIP5 转录因子 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2023)03-0544-06 Transcription factor activation analysis based on yeast homologous recombination PEI Hao,LI Wantong,ZHOU Xiaolin,YU Min,TAO Fang(School of Life Scienc
4、es,Anhui Agricultural University,Hefei 230036)Abstract:Transcriptional activation verification of transcription factor is one of the effective methods to an-alyze the activity.The bZIP5 is involved in fungal growth and development in Aspergillus flavus.To identify its transcriptional activity,expres
5、sion vectors were constructed based on pGBKT7 through homologous recombina-tion in yeast,and which were compared with the recombinant enzyme method.The results showed that the con-struction of pGBKT7-bZIP5 by exogenous recombinant enzyme was laborious because the recombinant vector should be transfo
6、rmed to E.coli first,and then the plasmid was extracted and transformed to yeast AH109 for ac-tivation verification.However,in the yeast homologous recombination method,the vector construction and acti-vation verification were completed in one step by transforming the linearized vector and fragment
7、into AH109 simultaneously.Furthermore,21-30 bp of homologous sequences were sufficient for recombination,and the bZIP5 gene showed self-activation ability.Our results demonstrated that the method of vector construction based on yeast homologous recombination is feasible.This method provides a conven
8、ient way for the construction of yeast-based vector without providing exogenous recombinase.Key words:vector construction;homologous recombination;yeast;bZIP5 transcription factor 传统的酶切/酶连的载体构建的方法,是将目标载体、目的基因经限制性内切酶消化,T4 DNA 连接酶将其连接构成的重组载体,转化大肠杆菌感受态细胞后进行单克隆筛选。但是,这一方法受限于目标序列/载体的酶切位点、限制性内切酶的选择和酶切效果,尤其
9、是对于需要在载体中插入多个基因片段时,构建载体的效率极低。利用重组融合 PCR法构建载体,简化了多基因片段的连接1-5,但多数还需依赖酶切/酶连,将连接好的片段插入到载体中,对于目标序列中无法回避的酶切位点时,往往利用引物设计点突变来消除酶切位点6。且这一方法对 Taq DNA polymerase 的要求较高,重组片段较长时易出现序列错误。为此,人们开发出重组酶法构建载体,又称无缝克隆法载体构建,它利用同源50 卷 3 期 裴 浩等:基于酵母同源重组的转录因子活性分析 545 重组的原理,通过设计带有载体同源序列的引物进行目的基因扩增,通过外源重组酶将其与线性化载体共同孵育,使有同源序列的目
10、的基因和线性载体进行体外重组连接,然后转入感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆。这种方法相对传统的酶切/酶连法较为简单,可以快速有效地获得目标重组载体,但有研究表明,其假阳性率较高7,其次成本不低。酵母细胞内具有高效的同源重组修复双链DNA 断裂(double-strand breaks,DSB)的机制8-9。利用这一同源重组系统,可以实现载体构建,主要依赖于外源基因片段两端与载体上同源序列,在酵母细胞内实现重组,拼接成目标载体10-11。本文对黄曲霉家族 bZIP5 转录因子在酵母体内进行转录激活验证,利用酵母自身的同源重组系统构建载体,并与外源重组酶法进行比较。同时,还考察了不同长度的同源序列对酵
11、母体内重组法的影响,为载体构建提供更为便捷的途径。1 材料与方法 1.1 供试菌株及载体 酵母 AH109 和载体 pGBKT7 为安徽农业大学杨俊老师惠赠。大肠杆菌 DH5,黄曲霉菌NRRL3357 为本实验室保藏的菌株。1.2 培养基 YPD 培养基:10 g L-1 Yeast extraction,20 g L-1 Peptone,20 g L-1 D-glucose,20 g L-1 Agar(液体培养基不加)。单缺培养基(SD/-Trp):6.7 g L-1 Yeast nitrogen base W/O amino acids,20 g L-1 D-glucose(需单独灭菌),
12、1.19 g L-1 二缺粉末(-Leu/-Trp),1 mmol L-1 Leu,20 g L-1 Agar。三缺培养基(SD/-Ade/-His/-Trp):Yeast nitrogen base W/O amino acids 6.7 g,D-glucose 20 g L-1(需单独灭菌),四缺粉末(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)1.15 g L-1,1 mmol L-1 Leu,20 g L-1 Agar。1.3 主要试剂 10 LiAc:1 mol L-1 LiAc,pH 7.5;1 LiAc/40%PEG-4000/1 TE:1 mL 10 LiAc、1 mL 10
13、 TE、4 g PEG-4000 加水定容至 10 mL,过滤除菌。1.4 重组酶法载体构建 以黄曲霉 NRRL 3357 的 cDNA 为模板,bZIP5-21F/bZIP5-21R(表 1)为引物对,TransStart FastPfu 酶(北京,全式金)扩增转录因子 bZIP5 基因 CDS 片段并测序。以 EcoR和 BamH(Takara)双酶切载体 pGBKT7,使之线性化。于 bZIP5 基因片段和线性载体中加入重组酶 Exnase II(诺唯赞,南京),获得 pGBKT7-bZIP5 重组载体,转化 DH5。以引物对 bZIP5-21F/bZIP5-21R 和 T7-f/BD-
14、r(表 1)分别进行 PCR 验证。1.5 酵母感受态细胞的制备 挑 AH109 单菌落于 5 mL YPD 培养基中,30,230 r min-1,振荡培养 18 h。取菌液约 1 mL 于 50 mL YPD 液体培养基,使其 OD600 为 0.4,继续恒温振荡培养约 5 h,至其 OD600为 1.0 左右。2 500 r min-1,4,离心 5 min;加入 40 mL 1 TE 后再次重悬并离心;最后加入 2 mL 1 LiAc/0.5 TE,备用。1.6 热激法转化酵母感受态细胞 取 pGBKT7-bZIP5 重组质粒 5 L,加入 10 L变性鲑精 DNA(10 mg mL-
15、1)混匀。再加入 100 L感受态酵母细胞、700 L 1LiAc/40%PEG-4000/1 TE,于 30、200 r min-1条件下,振荡培养 0.5 h。添加 88 L 二甲亚砜并充分混合,42 水浴 5 min后,冰浴 2 min。8 000 r min-1离心 10 s,留沉淀。加 1TE 100 L 重悬细胞。取 50 L 涂布于单缺培养基和三缺培养基上,于 30 恒温培养,直至观察到菌落的出现。同时以酵母感受态细胞、转化了空载体 pGBKT7 的酵母细胞为对照。表 1 本研究所用的引物 Table 1 Primers used in this study 引物名称 序列(5-
16、3)bZIP5-21F ATGGCCATGGAGGCCGAATTC-ATGTCAGATGAGCACATCGCTC bZIP5-21R CCGCTGCAGGTCGACGGATCC-CTAGTTATCGGTGCCCACACCC bZIP5-25F GCATATGGCCATGGAGGCCGAATTC-ATGTCAGATGAGCACATCGCTC bZIP5-25R GCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-CTAGTTATCGGTGCCCACACCC bZIP5-30F GACCTGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTC-ATGTCAGATGAGCACATCGCTC bZIP5-
17、30R GTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-CTAGTTATCGGTGCCCACACCC T7-f TAATACGACTCACTATAGGGC BD-r TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC 1.7 酵母同源重组一步法构建载体 设计含不同长度同源序列的引物(表 1),重组质粒 pGBKT7-bZIP5 作模板,PCR 扩增目的基因bZIP5片段。EcoR和 BamH双酶切载体 pGBKT7。将线性载体 pGBKT7 和 bZIP5 片段按 1:2 的摩尔比混合,转化酵母感受态细胞,涂布于单缺培养基和三缺培养基上。将三缺板上长出的单菌落,分别点涂到单缺和三缺
18、培养基上面,再次筛选验证。挑取三缺板上的单菌落,提取质粒为模板,以不同长度同源序546 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 列的 bZIP5 引物,用 EasyTaq 酶(北京,全式金)进行菌落 PCR。同时,以 T7-f/BD-r 为引物对,再次 PCR 测序验证。2 结果与分析 2.1 重组酶法构建载体及 bZIP5 自激活探究 本研究利用酵母双杂载体pGBKT7进行转录因子 bZIP5 自激活验证,bZIP5 基因将插入到pGBKT7载体的多克隆位点(图 1)。利用重组酶法,将 bZIP5转录因子 CDS 序列(831 bp)与线性化的 pGBKT7进行重组。按照重组酶试剂盒的
19、说明,bZIP5 基因片 段 扩 增 采 用 的 是 21 bp 链 接 头 的 引 物 对bZIP5-21F/bZIP5-21R。将重组反应体系转化大肠杆菌,提取质粒,酶切结果表明,bZIP5 基因片段已插入 pGBKT7 载体中(图 2A)。为进一步验证外源基因片段插入的准确性,对获得的 pGBKT7-bZIP5 重组载体,利用 T7-f/BD-r 引物进行 PCR 扩增并测序。T7-f/BD-r 引物为载体 pGBKT7 上的测序引物,引物间的原序列长度为 299 bp,在 EcoR和 BamH 之间插入 bZIP5 基因片段后,引物间序列长度约为 1 130 bp(图 2B)。测序结果
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