利用CRISPR_Cas9...k3基因探讨其对血压的影响_高诗娟.pdf
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1、 高诗娟 等/利用 CRISPR/Cas9 系统敲除小鼠 Mlk3 基因探讨其对血压的影响 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1644-1654 DOI:10.13345/j.cjb.221022 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目:国家自然科学基金(91939106,81770470);北京市自然科学基金(7192032)This work was supported by the National Natural Science Foundation of
2、 China(91939106,81770470)and the Beijing Natural Science Foundation(7192032).*Corresponding author.E-mail:gao_ Received:2022-12-22;Accepted:2023-02-16 1644 生物工程学报 利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠Mlk3基因探讨其对血压的影响 高诗娟*,方光明,张燕红,杜杰 首都医科大学附属北京安贞医院 北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029 高诗娟,方光明,张燕红,杜杰.利用 CRISPR/Cas9系统敲除小鼠 Mlk3基因探讨其对血压
3、的影响J.生物工程学报,2023,39(4):1644-1654.GAO Shijuan,FANG Guangming,ZHANG Yanhong,DU Jie.Generation of Mlk3 KO mice by CRISPR/Cas9 and its effect on blood pressureJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1644-1654.摘 要:为探讨混合谱系激酶 3(mixed lineage kinase 3,Mlk3)基因敲除(knockout,KO)对小鼠血压的影响,采用 CRISPR/Cas9 系统构建
4、 Mlk3 基因敲除(Mlk3 knockout,Mlk3KO)小鼠模型。T7 核酸内切酶 I(T7 endonuclease I,T7E1)酶切法验证向导 RNA(small guide RNA,sgRNA)的活性。体外转录 CRISPR/Cas9 mRNA 及 sgRNA,显微注射至受精卵并移植入假孕母鼠。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及 DNA 测序检测基因型。实时荧光定量 PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测 Mlk3 mRNA 表达,Western blotting 及免疫荧光检测 Mlk3 蛋白表达。尾套法监测小鼠血压
5、。免疫组化及 Western blotting 检测小鼠主动脉肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化水平。PCR 基因型鉴定及 DNA 测序显示 Mlk3 敲除成功,且 Mlk3 敲除小鼠未检测到 Mlk3 蛋白表达,证实 CRISPR/Cas9 系统成功构建了 Mlk3 敲除小鼠。Mlk3 敲除小鼠在基础状态下血压显著高于同笼对照,且 Mlk3 敲除小鼠主动脉平滑肌层 MLC 的磷酸化高于对照组,说明 Mlk3 具有抗高血压的内源性保护作用。本研究为探讨蛋白激酶 Mlk3 抗高血压及抗高血压诱导心血管不良重塑的作用机制提供了理想的动物模型。关键词:基因敲除;小鼠;
6、CRISPR/Cas9;混合谱系激酶 3;血压;肌球蛋白轻链 医药生物技术 高诗娟 等/利用 CRISPR/Cas9 系统敲除小鼠 Mlk3 基因探讨其对血压的影响 :010-64807509: 1645 Generation of Mlk3 KO mice by CRISPR/Cas9 and its effect on blood pressure GAO Shijuan*,FANG Guangming,ZHANG Yanhong,DU Jie Beijing Institute of Heart,Lung and Vascular Diseases,Beijing Anzhen Hosp
7、ital,Capital Medical University,Beijing 100029,China Abstract:To explore the effect of Mlk3(mixed lineage kinase 3)deficiency on blood pressure,Mlk3 gene knockout(Mlk3KO)mice were generated.Activities of sgRNAs targeted Mlk3 gene were evaluated by T7 endonuclease I(T7E1)assay.CRISPR/Cas9 mRNA and sg
8、RNA were obtained by in vitro transcription,microinjected into zygote,followed by transferring into a foster mother.Genotyping and DNA sequencing confirmed the deletion of Mlk3 gene.Real-time PCR(RT-PCR),Western blotting or immunofluorescence analysis showed that Mlk3KO mice had an undetectable expr
9、ession of Mlk3 mRNA or Mlk3 protein.Mlk3KO mice exhibited an elevated systolic blood pressure compared with wild-type mice as measured by tail-cuff system.Immunohistochemistry and Western blotting analysis showed that the phosphorylation of MLC(myosin light chain)was significantly increased in aorta
10、 isolated from Mlk3KO mice.Together,Mlk3KO mice was successfully generated by CRISPR/Cas9 system.MLK3 functions in maintaining blood pressure homeostasis by regulating MLC phosphorylation.This study provides an animal model for exploring the mechanism by which Mlk3 protects against the development o
11、f hypertension and hypertensive cardiovascular remodeling.Keywords:gene knockout;mouse;CRISPR/Cas9;mixed lineage kinase 3;blood pressure;myosin light chain 中国高血压患者数高达 2.45 亿,严重危害国民健康。多种发病机制,包括交感神经活动亢进、肾素血管紧张素醛固酮系统激活以及血管内皮细胞功能受损等,导致血容量改变、心输出量增加、外周血管阻力增加而引起血压升高1。高血压的病因不同,相应的药物干预措施也不同2。揭示高血压发病机制对个体化用药具
12、有重要意义。混合谱系激酶 3(mixed lineage kinase 3,Mlk3)是一种表达于肺、肝及心脏等多种组织的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Mlk3 通过激活 MAPK 通路下游细胞外信号相关激酶(extracellular signal-related kinases,ERK)、c-Jun 氨 基 末 端 激 酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及丝裂原活化蛋白激酶p38 等,调控细胞增殖、分化和凋亡3-4。最近研究发现 Mlk3 基因缺失导致心血管系统功
13、能异常,如 Mlk3 基因敲除鼠心功能下降5;血管损伤后 Mlk3 基因敲除鼠平滑肌细胞异常增殖并形成更厚的新生内膜,而内膜增厚将增加血管堵塞的风险6。上述研究提示 Mlk3 在心血管系统中发挥内源性保护作用。平滑肌细胞收缩增强是外周血管阻力增加、高血压发生的重要病理基础7-8,Mlk3 基因敲除鼠在血管损伤后平滑肌细胞异常增殖,促使我们探讨 Mlk3 基 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1646 因敲除是否影响小鼠血压。为此,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Mlk3基因敲除鼠模型9-11,探讨
14、Mlk3 是否参与血压调控。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞及动物 小鼠胚胎成纤维细胞系 NIH3T3 购自国家实验细胞资源库北京总部(协和),培养于 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中。1012 周龄 SPF级 C57BL6/J 小鼠购自北京唯尚立德生物科技有限公司,以 C57BL6/J 为背景构建 Mlk3 基因敲除小鼠。实验用鼠繁殖及饲养于北京安贞医院 SPF 级动物房。所有动物实验均遵守首都医科大学附属北京安贞医院实验动物管理委员会的相关规定(动物伦理批准号:GZR-2-009)。1.1.2 主要试剂 T4 DNA 连接酶、T7E1 外切酶、Bbs I 限制性内切酶购自
15、 NEB(北京)有限公司。高保真 DNA 聚合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。Px459 载体来自麻省理工学院 Feng Zhang 实验室捐赠至 Addgene 质粒库。无内毒素质粒提取试剂盒、蛋白酶 K 购自天根生化科技(北京)有限公司。鼠尾裂解液 DirectPCR Lysis Reagent 购自 Viagen Biotech 公司;SYBR real-time PCR 试剂购自 TaKaRa 公司。胎牛血清、DMEM 细胞培养基、Lipofectamine 3000转染试剂、T7 体外转录试剂盒、SP6 体外转录试剂盒、MEGAclear转录纯化试剂盒、TRIzol、T-PER
16、 组织蛋白提取液、逆转录试剂 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Thermo Fisher Scientific 公司。Mlk3(#4370S)抗体、p-MLC(phospho-Myosin Light Chain 2(Ser19),#3671S)抗体购自 Cell Signaling Technology 公司。用于免疫荧光检测的 Alexa Fluor-555 荧光二抗购自 Jackson ImmunoResearch 公司,用于Western blotting 检测的 IRDye800 偶联二抗购自Li-COR Bioscience
17、s 公司。DAPI 封片液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 方法 1.2.1 靶向 Mlk3 基因 sgRNA 寡核苷酸设计及表达质粒构建 采用 CRISPR/Cas9 技术构建 Mlk3 基因敲除小鼠。小鼠 Mlk3 基因(ID:26403)含有翻译起始密码子的第 3 个外显子两端分别设计上、下游两个向导 RNA(small guide RNA,sgRNA),通过两个 sgRNA 引导 CRISPR/Cas9 切除第3 个外显子导致 Mlk3 读码框架提前终止而达到敲除Mlk3基因的目的。应用http:/crispr.mit.edu/网站,分别选取 Mlk3 第 3 个外显子中包含
18、ATG序列的上下游 250 bp 以及包含该外显子最后一个碱基上下游 250 bp 的序列为模板,设计sgRNA。为确保选取的 sgRNA 有效切割目标片段,分别针对上下游模板各设计 3 个 sgRNA(表 1)。化学合成带有接头序列的 sgRNA 寡核苷酸双链,退火后通过 T4 DNA 连接酶连接入Bbs I 酶切的带有 CRISPR/Cas9 及 sgRNA 表达框的 px459 载体。DNA 测序确认载体构建成功。表 1 sgRNA 寡核苷酸序列 Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences sgRNA name Oligonucleotide sequ
19、ence(53)sgRNA1-F CACCGTACCGGTGGAGTCCGGCCGG sgRNA1-R AAACCCGGCCGGACTCCACCGGTAC sgRNA2-F CACCGATACCACGGGCACCCGAAGA sgRNA2-R AAACTCTTCGGGTGCCCGTGGTATC sgRNA3-F CACCGCCATGGCAGGGAGCCGGCGT sgRNA3-R AAACACGCCGGCTCCCTGCCATGGC sgRNA4-F CACCGTTCAGGTCTCGGTGTATCAC sgRNA4-R AAACGTGATACACCGAGACCTGAAC sgRNA5-F CAC
20、CGCTCGGAGCACGGCCCAGCCG sgRNA5-R AAACCGGCTGGGCCGTGCTCCGAGC sgRNA6-F CACCGGGGGCACACGCCGACCAGCC sgRNA6-R AAACGGCTGGTCGGCGTGTGCCCCC Bold:sgRNA sequence;Non-bold:Adapter sequence.高诗娟 等/利用 CRISPR/Cas9 系统敲除小鼠 Mlk3 基因探讨其对血压的影响 :010-64807509: 1647 1.2.2 CRISPR/Cas9-sgRNA 共表达质粒细胞转染 NIH3T3 细胞接种至 6 孔板,待细胞密度达到 8
21、0%左右,将 2 g px459-sgRNA 质粒用Lipofectamine 3000 试剂进行转染。转染后 36 h提取细胞基因组 DNA。1.2.3 T7E1 内切酶检测 sgRNA 活性 以转染了 px459-sgRNA 质粒的细胞基因组DNA 为模板,在 sgRNA 介导的编辑位点附近设计引物(表 2)进行 PCR 扩增。PCR 产物热变性、梯度退火后,利用 T7E1 内切酶于 37 C 反应 1 h,反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.4 CRISPR/Cas9 mRNA 及 sgRNA 显微注射至受精卵 CRISPR/Cas9 表达质粒在 Not I 酶切线性化后用 SP6
22、体外转录试剂盒转录。带有 T7 启动子的 sgRNA表达质粒使用 T7体外转录试剂盒进行转录。转录产物经 MEGAclear 转录纯化试剂盒进行纯化。CRISPR/Cas9 mRNA 及sgRNA 显微注射至受精卵,并移植入假孕母鼠的输卵管。胚胎移植的小鼠在术后 19 d 左右出生。1.2.5 小鼠基因型鉴定 胚胎移植小鼠出生后 7 d 左右采集鼠尾,用含蛋白酶 K 的鼠尾消化液 56 C 消化过夜,85 C 灭活,提取基因组 DNA。PCR 扩增 Mlk3目的片段,琼脂糖凝胶电泳及 DNA 测序鉴定基因型。PCR 引物见表 3。表 2 sgRNA 活性鉴定 PCR 引物 Table 2 PC
23、R primers for evaluation of sgRNA activity Primer name Primer sequence(53)Size(bp)sgRNA1-3-PCR-F CAGCCTGACCACACTGCCCT 612 sgRNA1-3-PCR-R CTTGCCGAAGCCACCGATGC sgRNA4-6-PCR-F CCATGCTGGCCCATCCCAAC 480 sgRNA4-6-PCR-R GGACTCCCAGGACAGAGGCA 表 3 Mlk3 基因型鉴定 PCR 引物 Table 3 PCR primers for Mlk3 genotyping Prim
24、er name Primer sequence(53)Primer1 GGAACTGAGGGACTCTGCTGC Primer2 TCCGAAGGCAACAGCAGCTTA Primer3 CACTGATAGGCCACGGGTATT 1.2.6 RNA 提取及 RT-PCR 利用TRIzol提取野生及Mlk3基因敲除鼠各3 只的主动脉组织总 RNA。取 2 g 总 RNA,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher)逆转录试剂盒逆转录生成cDNA。cDNA 在 iQ5 系统(Bio-Rad)中使用 SYBR 试剂(TaKaRa
25、)进行 RT-PCR。以 GAPDH 为内参基因,目标基因表达水平以 2Ct法进行计算。引物序列如表 4 所示。1.2.7 Western blotting 检测 利用 T-PER 组织裂解液(补充 0.5 mol/L EDTA,蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂)提取对照及 Mlk3 基因敲除鼠血管组织总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度。将 6080 g 的总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,电转至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭 45 min,加入MLK3(1:1 000)及 GAPDH(1:1 000)抗体,4 C孵育过夜。IRDye800 偶联二抗室温孵育 2 h后 Odyssey 红外荧光扫描
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