淋病奈瑟菌感染小鼠脾脏单个...P3、IL-1β表达的影响_魏娜.pdf
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1、第 41 卷第 2 期2023 年 4 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.2Apr.2023132淋病奈瑟菌感染小鼠脾脏单个核细胞对NLRP3、IL-1 表达的影响 魏娜1,张方2,李街青2,陈佳玲2,史建强2*,陈嵘祎1*(1.南方医科大学皮肤病医院,广东广州 510091;2.广东医科大学附属医院,广东湛江 524001)摘要:目的研究淋病奈瑟菌(Ng)感染小鼠脾脏单个核细胞对NLRP3、IL-1 表达的影响。方法通过测定不同稀释度Ng 菌液OD450值,结合平板菌落计数法,建立淋病奈瑟菌OD450值(x)-
2、活菌数(y)回归方程。不同浓度Ng 悬液感染小鼠脾脏单个核细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot 检测NLRP3、IL-1 水平。结果成功建立了淋病奈瑟菌OD450值(x)-活菌数(y)回归方程:y=287.65x-30.583。qRT-PCR、Western blot 结果显示,以OD450值=0.2 Ng 悬液感染单个核细胞 1 h,NLRP3、IL-1 表达量最高。结论利用OD 值计数Ng 简便、快捷;NLRP3、IL-1 在Ng感染中起关键作用。关键词:淋病奈瑟菌;小鼠;脾脏;NLRP3;IL-1中图分类号:R 575 文献标志码:A 文章编号:209
3、6-3610(2023)02-0132-05Effect of Neisseria gonorrhoeae infection on NLRP3 and IL-1 expression in spleen mononuclear cells of mice WEI Na1,ZHANG Fang2,LI Jie-qing2,CHEN Jia-ling2,SHI Jian-qiang2*,CHEN Rong-yi1*(1.Dermatology Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510091,China;2.Department of D
4、ermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of Neisseria gonorrhoeae(Ng)infection on NLRP3 and IL-1 expression in spleen mononuclear cells of mice.MethodsThe OD450 value(x)-viable count(y)regression equation of
5、Ng was established by OD value measurement of different Ng dilutions and plate colony counting.The spleen mononuclear cells of mice were infected with different Ng concentrations,and their expression NLRP3 and IL-1 was detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsThe OD450 value(x)-viable count(y)reg
6、ression equation of Ng was established:y=287.65x-30.583.qRT-PCR and Western blot showed that NLRP3 and IL-1 expression reached the top in mononuclear cells infected with OD450 value=0.2 Ng suspension for 1 h.ConclusionOD450 value is simple and rapid for Ng counting.NLRP3 and IL-1 play a key role in
7、Ng infection.Key words:Neisseria gonorrhoeae;mice;spleen;NLRP3;IL-1淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,Ng)感染引起的性传播疾病1,该菌感染常引起模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)激活。PRRs 包括 Toll 样受体(toll-like receptors,TLRs)、C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLR)、RIG-样受体(RIG-like receptors,RLRs)、NOD 样受体(NOD-like rece
8、ptors,NLRs)、AIM2 样受体(Aim2-收稿日期:2022-12-20基金项目:广东省科技创新战略专项基金(2021A1515011218),广州市科技计划项目(202002030106),国家自然科学基金(81872532)作者简介:魏娜(1996-),女,在读硕士研究生,E-mail:张方(1993-),女,硕士研究生,E-mail:,为共同第一作者通信作者:陈嵘祎(1977-),男,博士,主任医师,E-mail:R史建强(1961-),男,本科,主任医师,E-mail:like receptors,ALRs),可识别入侵微生物表达的病原相关分子模式(Pathogen-asso
9、ciated molecular patterns,PAMPs)及组织损伤释放的内源性危险相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)。其中TLRs、NLRs 在细菌感染中研究较多,而NLRP3 是属于NOD 样受体的一种,细菌感染可激活宿主免疫细胞NLRP3 来上调IL-1 以抵抗感染。体外细胞实验研第2期魏娜,等.淋病奈瑟菌感染小鼠脾脏单个核细胞对 NLRP3、IL-1 表达的影响 133究Ng 的感染条件与宿主引起免疫应答对该病致病机制研究非常关键,然而Ng 体外感染单核细胞实验最佳活菌含量罕见报道,本文通过研究Ng 定量方法以及不
10、同含量Ng 感染单个核细胞对IL-1、NLRP3 表达的影响,为后续体外Ng 感染免疫实验研究提供理论依据。1材料和方法1.1材料 1.1.1 致病菌和C57/BL6J 小鼠 淋病奈瑟菌菌株,购于上海宜醇化工有限公司,菌种编号 19424;C57/BL6J 小鼠,购于广东省医学动物中心。1.1.2 主要仪器与试剂SW-CJ-2FD 型超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司),酶标仪、CO2 培养箱(美国Thermo SCIENTIFIC),高速低温台式离心机(美国Thermo),VininTM7 Dx Real-Time PCR 仪(美国Life),倒置显微镜(日本OLYMPUS),分光
11、光度计(德国Eppendorf),电泳槽(美国Thermo),转膜槽(美国Bio-Rad),Azure C500 多功能分子成像分析仪(美国Thermo),小鼠单个核细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司),淋病奈瑟菌选择培养基(江门凯林公司),澳洲源胎牛血清(美国Gibco),RPMI 1640 完全培养基、PBS 缓冲液(美国 Gibco),Trizol(美国Ambion),qRT-PCR 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TM II 试剂盒(日本TaKaRa),RIPA 裂解液(10)、蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail(100)、兔抗GAPDH抗体、兔抗IL-1
12、抗体、抗兔IgG、HRP-linked 抗体(美国 Cell Signaling Technology),兔抗 NLRP3 抗体(英国 Abcam),红细胞裂解液(1)、NuPAGE TM10%Bis-Tris Gel 胶、MES-SDS Running Buffer(20)(美国 Invitrogen),immobilon Western HRP 底物(美国Millipore)、Braford 蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(中国碧云天有限公司),TBS 干粉(中国博士德生物有限公司),70 m 孔径尼龙细胞筛(美国Corning),脂多糖LPS(美国Sigma)。1.2方法1.2.1菌
13、液OD 值测定将Ng 接种于Ng 选择培养基,置于 37、5%CO2培养箱中培养 24 h,用接种环挑取单个菌落于含 10%胎牛血清的 1640 培养液中制成细菌悬液。以未加菌的培养液为空白对照液调零,波长 450 nm 测量OD 值,选取OD 值在 0.61.0 之间的菌液进行 11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0梯度稀释,并测量其OD450值。1.2.2 菌落平板计数 将按 11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0 梯度稀释的各组菌液进行 10、10210n倍比稀释,吸取 1 mL 稀释后的菌液均匀涂布于固体培养基上,置于 37、5%CO2培养箱中培
14、养 24 h。选取培养基上菌落数为 30300 个对应的稀释倍数为最佳稀释倍数,准确计数培养基上菌落数,再乘以稀释倍数 10n,为 1 mL 菌液中的活菌数(CEU/mL),即菌液中Ng 活菌的含量。1.2.3回归方程计算以菌落数为y 值,菌液OD450值为x 值,计算相关回归方程。1.2.4 小鼠脾脏单个核细胞获取 于超净工作台中无菌操作取出C57/BL6J 小鼠脾脏,以PBS 漂洗 2 次后,以磨砂玻片轻轻研磨,用细胞筛过滤获得悬浊液4 mL。将此悬浊液移至已盛有单个核细胞分离液的离心管中,悬浊液与单个核细胞分离液体积之比为14,以 500g 离心 30 min,分 4 层,取上数第 2
15、层,即单个核细胞层。加入适量PBS 液漂洗 1 次,加入红细胞裂解液 2 mL,吹打混匀 2 min,再加入PBS 漂洗 1次即可获得高纯度的单个核细胞。1.2.5RT-qPCR 检测单个核细胞中 IL-1、NLRP3 mRNA 表达水平 将OD450值为 0.2、0.6、1.0、1.4 的Ng 悬液与单个核细胞置于含 10%胎牛血清的 1640培养基中共培养 1、2、6、12 h,此为实验组;设置不加入Ng 的空白对照组计OD450值为 0。培养结束后,采用梯度离心去除Ng,收集单个核细胞。运用Trizol 法提取细胞总RNA,采用随机引物法反转录为cDNA,以SYBR Green 核酸染料
16、为荧光探针,用Real-time PCR检测细胞IL-1、NLRP3 的mRNA 表达。选取上调IL-1、NLRP3 mRNA 表达量最高的 OD450 值的Ng 悬液与单个核细胞置于含 10%胎牛血清的 1640 培养基中共培养,并设立脂多糖LPS 单阳性对照组,在培养 0、1、2、6、12、24 h 后分别收集单个核细胞,并采用梯度离心去除Ng。同样运用Trizol 法提取细胞总RNA,采用随机引物法反转录为cDNA,以SYBR Green 核酸染料为荧光探针,用Real-time PCR 检测细胞IL-1、NLRP3 mRNA 表达量。每个样品均设置 3 个复管,重复试验3 次。分别测定
17、对照组和试验组目的基因与内参基因的Ct 值,实验结果取其均值,采用 2CT法对各组基因 mRNA 表达水平进行相对定量分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计,序列如下:IL-1-F:5 CTGCTGGTGTGTGACGTTC C3 IL-1-R:5 ATATGGGTCCGACAGCACGA3;NLRP3-F:5 TGCACACAGTGGTGTTCCAG3 NL RP3-R:5 TCACCTCTCGGCAGTGGATA3;GAP 广东医科大学学报1342023年 第41卷DH-F:5 TGCACCACCAACTGCTTAG3 GAPDH-R:5 GGATGCAGGGATGATGTTC3
18、。1.2.6 蛋白免疫印迹检测 IL-1、NLRP3 表达 选取上调 IL-1、NLRP3 mRNA 表达水平最高的 OD450值的Ng 悬液与单个核细胞置于含 10%胎牛血清的1640 培养基中共培养,并设立脂多糖LPS 单阳性对照组,在培养 0、1、2、6、12、24 h 后分别收集单个核细胞,并采用梯度离心去除Ng。收集细胞悬液,通过裂解、离心留取上清作为样品,使用Bradford 蛋白测定法检测总蛋白浓度。等量蛋白质上样、电泳、转膜,5%BSA 的TBST 封闭液室温缓慢摇动 60 min。TBST 液快速洗涤 5 min,重复 3 次。加入一抗(工作液浓度为11 000)室温摇床孵育
19、 2 h,4 过夜,洗膜,孵育二抗,洗膜,显影。结果分析:以GAPDH 为内参,比较目的蛋白表达水平。1.2.7统计学处理以SPSS13.0 软件进行统计学处理,计量资料以x-s 表示,使用单因素方差分析及q 检验,P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1建立NgOD450值(x)-活菌数(y)回归方程 经过计数培养基上菌落数目,选择最佳稀释倍数为 106,计数此稀释倍数下不同OD 值菌液接种于固体培养基上的菌落数,计算OD 值与活菌数的回归方程(表 1)。2.2不同含量Ng 悬液感染单个核细胞对IL-1、NLRP3 mRNA 表达水平的影响 实时荧光定量PCR 相对定量分析显示,将菌液O
20、D450值为 0 的空白对照组IL-1、NLRP3 mRNA 表达量设为 1,实验组IL-1、NLRP3 mRNA 相对表达量随Ng 含量升高出现先升高后下降的趋势,菌液OD 值为0.2的实验组IL-1 mRNA相对表达量最高(P0.01),见表 2。OD 值为 0.2 的实验组NLRP3 mRNA 相对表达量也最高(P0.01),见表 3。2.3Ng 感染单个核细胞不同时间点的IL-1、NLRP3表达 实时荧光定量PCR 相对定量分析显示,将培养时间为 0 h 的IL-1、NLRP3 mRNA 表达量设为 1,余时间点的 IL-1、NLRP3 mRNA 表达量随着培养时间延长出现先升高后下降
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