基于转录组测序分析芍药苷诱...腔黏膜上皮细胞差异表达基因_肖丽君.pdf
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1、基金项目 国家自然科学基金(编号:8 1 9 6 0 2 0 2)贵州 省 科 技 计 划 项 目(编 号:黔 科 合 基 础-Z K2 0 2 3 一般5 3 4)作者简介 肖丽君(1 9 9 6),女,山东威海人,医师,硕士在读,研究方向:口腔黏膜疾病的防治。*通信作者 杨建堂,E-m a i l:9 4 5 8 1 0 9 3 4q q.c o m口腔生物学研究基于转录组测序分析芍药苷诱导下口腔黏膜上皮细胞差异表达基因肖丽君1 陈谦明2 吴玉琪1 杨建堂3*1.遵义医科大学口腔医学院 贵州 遵义 5 6 3 0 0 6;2.浙江大学口腔医学院 浙江 杭州 3 1 0 0 0 5;3.遵义
2、医科大学附属口腔医院黏膜科 贵州 遵义 5 6 3 0 0 6 摘要 目的:基于转录组测序分析芍药苷调控人口腔黏膜上皮细胞基因表达的情况,分析关键基因,探讨芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用机制以及其药用价值。方法:实验分为3组,空白对照组、低浓度(5 m o l/L)和高浓度(1 0 m o l/L)芍药苷组处理口腔黏膜上皮细胞系L e u k-1,进行转录组测序分析,从而筛选出差异表达基因(D E G s),采用G O和K E G G富集分析对D E G s进行基因功能和途径注释。结果:芍药苷诱导下,L e u k-1细胞中共有1 2 1 2个显著D E G s;G O富集分析显示,D E
3、G s显著富集在免疫反应、体液免疫应答反应、细胞因子介导的通路反应2-5 寡腺苷酸合成酶活性、丝氨酸内酞酶活性、细胞外空间、细胞外组分和内质网等功能中;K E G G通路富集显示,D E G s显著富集在单纯疱疹病毒感染、癌症通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、人类乳头瘤病毒感染等信号通路中;采用实时荧光定量P C R技术检测了参与芍药苷诱导的L e u k-1细胞差异表达的基因,其趋势域R NA-s e q一致,可以验证R NA-s e q技术的准确性。结论:芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用主要体现在抗病毒感染、肿瘤抑制、保护上皮完整性以及免疫调节等方面。关键词 芍药苷;口腔黏膜上皮细胞;
4、转录组测序;差异基因表达;免疫调节 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 60 5 2 70 7d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 6.0 1 2T r a n s c r i p t o m e S e q u e n c i n g S c r e e n e d D i f f e r e n t i a l l y E x p r e s s e d G e n e s i n L e u k-1 C e l l s u n d e r P a e o n i f l o r i
5、n C o n d i t i o n.X I-A O L i j u n1,CHEN Q i a n m i n g2,WU Y u q i1,Y ANG J i a n t a n g3*.1.S c h o o l o f S t o m a t o l o g y,Z u n y i M e d i c a l U n i-v e r s i t y,Z u n y i 5 6 3 0 0 6,C h i n a;2.S c h o o l o f S t o m a t o l o g y,Z h e j i a n g U n i v e r s i t y,H a n g z h
6、 o u 3 1 0 0 0 5,C h i n a;3.D e p a r t m e n t o f M u c o s a,H o s p i t a l o f S t o m a t o l o g y,Z u n y i M e d i c a l U n i v e r s i t y,Z u n y i 5 6 3 0 0 6,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o a n a l y z e t h e g e n e e x p r e s s i o n o f L e u k-1 c e l l s r e g u
7、 l a t e d b y p a e o n i f l o r i n b a s e d o n t r a n s c r i p-t o m e s e q u e n c i n g,t o e x c a v a t e a n d a n a l y z e k e y g e n e s,t o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f p a e o n i f l o r i n o n L e u k-1 c e l l s,a n d t o e x p l o r e i t s m e d i c i n a l v a l u
8、 e.M e t h o d s:T r a n s c r i p t o m e a n a l y z e w e r e c a r r i e d o u t o n L e u k-1 c e l l s i n z e r o,l o w(5 m o l/L),a n d h i g h(1 0 m o l/L)c o n c e n t r a t i o n g r o u p s.A s e r i e s o f d i f f e r e n t e x p r e s s i o n g e n e s(D E G s)w e r e s c r e e n e d,
9、a n d t h e g e n e f u n c t i o n a n d p a t h w a y s o f D E G s w e r e a n n o t a t e d b y G e n e O n t o l o g y e n r i c h m e n t a n d K E G G e n-r i c h m e n t a n a l y s i s.R e s u l t s:Am o n g 1 2 1 2 D E G s i d e n t i f i e d i n L e u k-1 c e l l s u n d e r t h e i n f l
10、 u e n c e o f p a e o n i f l o r i n,G e n e O n t o l-o g y e n r i c h m e n t a n a l y s i s r e v e a l e d s i g n i f i c a n t e n r i c h m e n t i n i mm u n e r e s p o n s e,h u m o r a l i mm u n e r e s p o n s e,c y t o k i n e-m e d i a t e d s i g n a l i n g p a t h w a y,2-5-o l
11、 i g o a d e n y l a t e s y n t h e t a s e a c t i v i t y,s e r i n e-t y p e e n d o p e p t i d a s e a c t i v i t y,e x t r a c e l l u l a r s p a c e,e x t r a-c e l l u l a r r e g i o n,e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,a n d o t h e r p a t h w a y s.K E G G p a t h w a y s e n r i
12、 c h m e n t i n d i c a t e d t h a t D E G s w e r e s i g n i f i-c a n t l y e n r i c h e d i n H e r p e s s i m p l e x v i r u s 1 i n f e c t i o n,p a t h w a y s i n c a n c e r,c y t o k i n e-c y t o k i n e r e c e p t o r i n t e r a c t i o n,h u m a n p a p-i l l o m a v i r u s i n
13、 f e c t i o n,a n d o t h e r p a t h w a y s.R T-q P C R e x a m i n a t i o n o f D E G s c o n f i r m e d t h a t a c c u r a c y o f R N A-s e q a n a l y s i s.T h e r o l e o f p a e o n i f l o r i n w a s m a i n l y r e f l e c t e d i n a n t i v i r a l i n f e c t i o n,t u m o r i n h
14、 i b i t i o n,p r o t e c t i o n o f e p i t h e l i a l i n t e g r i t y,a n d i mm u n e r e g u l a t i o n.C o n c l u s i o n:T h e r e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t p r o v i d e d a r e f e r e n c e t o f u r t h e r s t u d y t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m a n d p
15、r o v i d e d c l u e s t o e x p l o r e t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f o r a l m u c o s a l d i s e a s e s.K e y w o r d s p a e o n i f l o r i n;L e u k-1;t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g;d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s;i mm u n o m o
16、 d-u l a t i o n 口腔黏膜病病种繁多,大多病因不明,防治困难。目前研究表明,许多口腔黏膜疾病的发病与免疫725 口腔医学研究2 0 2 3年6月第3 9卷第6期因素有关,因此积极探索调节口腔黏膜上皮免疫功能的方法可能对口腔黏膜病的防治具有重要意义。芍药苷(p a e o n i f l o r i n,P F)是白芍总苷的主要活性成分,主要从白芍的干燥根中提取。芍药苷对黏膜具有保护作用1-4:诱导气管上皮细胞分泌-防御素抵御病原微生物入侵5;增强肠上皮细胞的紧密连接,抑制内皮细胞损伤、改善十二指肠黏膜细胞屏障,抗炎抗菌;调节肠道菌群,减轻结肠炎6-9等。但芍药苷对口腔黏膜免疫功
17、能调节的研究较为少见。R NA-s e q是近年发 展起来的在 高通 量 平 台(I l l u m i n a)上对库进行排序用来检测样本差异基因(D E G s)表达的分子生物学工程。在本研究中,通过R NA-s e q技术比较正常口腔黏膜上皮细胞和芍药苷作用下口腔黏膜上皮细胞的基因表达差异,通过实时定量P C R(R T-q P C R)验证D E G s,根据结果进一步明确芍药苷的药用价值以及治疗口腔黏膜疾病的潜在机制。1 材料与方法1.1 材料和试剂 R PM I 1 6 4 0培养基(上海源培生物科技有限公司);胎牛血清(北京硕华佰奥生物科技有限公司);0.2 5%胰蛋白酶(G i
18、 b c o公司,美国);C C K-8(MC E,美国);芍药苷(上海毕得医药科技股份有限公司);R T-q P C R试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)。1.2 细胞培养 L e u k-1细胞系购自上海美轩生物技术 有 限 公 司,细 胞 系 用 含1 0%胎 牛 血 清 的R PM I 1 6 4 0培养基培养于3 7、5%C O2培养箱中,12 d换液,待细胞生长融合至8 0%时,用0.2 5%胰蛋白酶消化细胞,23 m i n后用完全培养基终止消化,以13的比例传代,取对数生长期的38代细胞用于实验。1.3 芍药苷对细胞活性影响 将L e u k-1细胞以31 04个细胞/孔接种
19、于9 6孔板,培养2 4 h后加入不同浓度芍药苷(0、2.5、5、1 0、2 0、4 0、8 0 m o l/L)处理不同时间(2 4、4 8、7 2 h),每组6个复孔(去掉最大值和最小值),C C K-8法检测细胞活性,确定最佳给药 浓 度 与 时 间。细 胞 分 组 处 理 后,每 孔 加 入1 0 L C C K-8溶 液,孵 箱 孵 育2 h,酶 标 仪 波 长4 5 0 n m处检测各孔吸光度(A)值,计算细胞活性。细胞活性=(实验组A值对照组A值)1 0 0%1.4 R NA-s e q结果及数据分析 根据C C K-8检测结果确定低浓度组、高浓度组和空白对照组。为进行R NA测
20、序分析,收集每组样本细胞(3个重复组),液氮速冻23 h后-8 0 保存,干冰送检测序分析。采用分子生物学先进设备检测R NA样品的浓度、纯度合格后,进行文库构建,使用Q-P C R方法对文库的有效浓度(2 n m o l/L)进行精准测量,保证文库质量,库检合格后将下级数据进行合并分析,用高通量平台进行测序。将得到的数据进行过滤,去除含有接头的和低质量的数据后得到高质量数据。经过测序质量控制,最终共得到6 2.2 5 G B可供分析的数据,各样品Q 3 0碱基百分比均不小于9 2.2 1%。随 后 利 用H I S AT 2系 统1 0将 数 据 与H o m o_s a p i e n s
21、.G R C h 3 8_r e l e a s e 9 5.g e n o m e.f a基因组进行序列比对,利用S t r i n g T i e1 1将比对成功的数据进行组装,随后采用F P KM1 2作为定量指标。使用e d g e R1 3进行差异分析,筛选出差异倍数(F o l d C h a n g e)1.0且显著性差异(P0.0 5)的差异基因合集。整个分析在BMK C l o u d(www.b i o-c l o u d.n e t)上进行。1.5 差异基因功能注释和分类 对差异表达基因进行数 据 库 的 功 能 注 释,包 括 基 因 本 体 论(g e n e o n
22、 t o l o g y,GO)、真核同源群簇(c l u s t e r s o f e u K a r y-o t i c o r t h o l o g o u s g r o u p s,KOG)、京都基因与基因组百 科 全 书(K y o t o e n c y c l o p e d i a o f g e n e s a n d g e-n o m e s,K E G G)数据库进行序列比对。1.6 R T-q P C R检测数据可靠性 收集不同浓度芍药苷处理后的细胞,利用吸附柱法提取总R NA,测定R NA浓度和纯度,用反转录试剂盒将R NA反转录为c D NA,随后 按照q
23、P C R试剂盒 将目的基因mR NA扩增,反应体系为:2 L c D NA、1 0 m o l/L上下游模板0.4 L、2C h a mQ U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x 1 0 L以及d d H2O 7.2 L;反应条件:预变性9 5 3 0 s,9 5 1 0 s、6 0 3 0 s 4 0个循环,记录循环阈值(C t值)。以GA P DH为内参,每组设置3个复孔,重复独立实验3次,用2-C t法分析基因相对表达量。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司设计合成,引物序列见表1。1.7 统计学分析 每项实验独立重复3次,
24、每组数据均满足正 态分布,具 有方差齐性,数据结果以?xs表示,采用G r a p h P a d P r i s m 9.0.0软件进行方差检验分析,以P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结果2.1 C C K-8法确定芍药苷作用浓度 C C K-8结果显 示,与 空 白 对 照 组 相 比,在2 4 h内 低 于1 0 m o l/L的芍药苷具有明显增强细胞活性的作用(P0.0 0 1),在4 8 h、7 2 h时,2 0 m o l/L浓度的825J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,J u n.2 0 2 3,
25、V o l.3 9,N o.6 表1 基因引物序列T a b.1 G e n e p r i m e r i n f o r m a t i o n基因名称引物序列(53)长度/b pT X N I PC C C T GAAAA G G T G T A C G GA T CC C T G C A T C C AAA G C1 3 1MX 1G C C A C A G C AA C T C C A T C T C T C CAAA C C T G C G C T C T1 0 9O S A 2T C C A C G T C C T G T C T G T T T C A T CT GA G C
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