间充质干细胞外泌体联合AL...轻APAP引起的肝细胞凋亡_马石楠.pdf
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1、doi:1013819/jissn2096708X202302005引用本文格式:马石楠,郭海珍,刘婷,等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡J湖北医药学院学报,2023,42(2):137142间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡马石楠,郭海珍,刘婷,朱景鸣,蒋宏宽,王小莉(湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北 十堰442000)摘要 目的:探讨间充质干细胞外泌体(MSCExos)联合肝再生增强因子(AL15)mNA 对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝细胞凋亡的影响。方法:通过 NAT 粒径检测
2、、TEM 电镜检测以及 Western Blot 鉴定提取的 MSCExos。通过免疫荧光和 Western Blot 鉴定体外合成 AL15 mNA。通过荧光染色、流式细胞术和 Western Blot 检测外泌体联合 AL15 mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响。结果:成功分离获得了 MSCExos,并体外成功合成了 AL15 mNA。外泌体联合 AL15 mNA 可进入肝细胞,通过抑制 OS 的生成使 APAP 诱导的肝细胞凋亡减轻,且外泌体联合 AL15 mNA 比仅添加外泌体的抗凋亡效果更好。结论:MSCExos 联合 AL mNA 可通过抑制 OS 产生减轻 APAP 诱
3、导的肝细胞凋亡,为干细胞外泌体联合 AL15 mNA 治疗 APAP 引起的肝细胞凋亡提供一个新的治疗思路。关键词 间充质干细胞外泌体;AL15;凋亡;肝细胞 基金项目 湖北省科技厅面上项目(2022CFB446);湖北省教育厅重点项目(D20222108);大学生创新创业训练项目(S202110929025)作者简介 马石楠(1983),女,河南濮阳人,高级实验师,研究方向:干细胞与疾病治疗。通信作者 王小莉(1983),女,湖北十堰人,博士,副教授,研究方向:干细胞治疗肝脏相关疾病。Email:Mesenchymal Stem Cell Exosomes Combined with AL1
4、5 mNA Attenuates APAPinduced Hepatocyte ApoptosisMA Shinan,GUO Haizhen,LIU Ting,ZHU Jingming,JIANG Hongkuan,WANG Xiaoli(Key Laboratory ofEmbryonic Stem Cell esearch of Hubei Province,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To investigate the effect of
5、 mesenchymal stem cell exosomes(MSCExos)combined with Augmenterof liver regeneration(AL15)mNA on Acetaminophen(APAP)induced hepatocyte apoptosis Methods MSCExoswere characterized by NAT particle size detection,transmission electron microscopy(TEM)and Western Blot The in vitrosynthesized AL15 mNA was
6、 identified by immunofluorescence and Western Blot The effects of MSCExos combinedwith AL15 mNA on APAPinduced hepatocytes apoptosis were detected by fluorescence staining,flow cytometry andWestern Blot esult MSCExos were successfully isolated and AL15 mNA was successfully synthesized in vitro MSCEx
7、os combined with AL15 mNA could entere the APAP treated hepatocytes and significantly reduced the cell apoptosisthrough inhibiting the OS production The antiapoptosis effect of exosomes combined with AL15 mNA was better thanthat of only exosomes Conclusion The MSCExos combined with AL mNA can allevi
8、ate APAPinduced hepatocyte ap-optosis by inhibiting OS production,which provides a new therapeutic idea for the treatment of APAPinduced hepatocyteapoptosis with stem cell exosomes combined with AL15 mNAKey words:Mesenchymal stem cell exosomes;Augmenter of liver regeneration;Apoptosis;Hepatocyte对乙酰氨
9、基酚(APAP)是一种全球常用的退热镇痛药物,在规定剂量范围内服用是比较安全的,当过量服用后,通常会引起肝细胞的凋亡坏死导致急性肝损伤,甚至急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)1。急性肝衰竭的治疗方法非常有限,肝脏移植是唯一有效的治疗方法,但由于肝脏供应不足、术731马石楠,等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡后并发症发生率高以及费用高昂而受到限制2。因此,寻找其他非手术治疗策略以提高肝损伤的治疗效果和自愈率是非常重要的。随着再生医学和干细胞技术的发展,以干细胞为基础的治疗策略将会为肝损伤引起的急性肝衰竭患者的治疗提供新的治疗手段
10、。外泌体是由细胞分泌进入细胞外液的单层膜囊泡,它们具有类脂双分子层,膜结构直径约为 30 200 nm,含有多种生物活性物质,如转录因子、mi-NA、lncNA 和 mNA 等,外膜保护这些分子在到达受体细胞之前不被分解3。外泌体是细胞间通讯的重要手段,它们在正常或病理条件下从不同类型的细胞中释放,通过携带遗传信号影响受体细胞的生物学特性,在免疫反应、免疫调节、炎性反应和干细胞表型转化中发挥重要作用4。干细胞来源的外泌体已被证实在多种疾病的治疗中发挥重要作用,如减轻冠状动脉疾病症状、促进皮肤愈合、促进受损肝脏、肾脏和神经的修复等57。肝再生增强因子(augmenterofliverregene
11、ration,AL)是一种调节增强因子,能促进肝脏中肝细胞的再生和 损 伤 修 复8。几 乎 所 有 器 官 中 都 含 有AL15 mNA,但其表达的蛋白质只存在于肝细胞中。这种蛋白质有两种存在形式,分子量大小分别为 22 kDa 和 15 kDa。其中小分子量形式的 AL15可以促进胞外生长因子的分泌,以保护肝细胞以及促进肝细胞的增殖与再生。当肝细胞受损时,AL在肝细胞中的表达下调,使肝脏的增殖再生能力减弱9。本研究将提取脐带间充质干细胞的外泌体,并体外合成 AL15 mNA,研究外泌体联合 AL15mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响,为干细胞外泌体联合 AL15 基因治疗 AP
12、AP 引起的肝细胞损伤导致的急性肝衰竭提供一个新的治疗思路。1材料和方法11主要试剂人正常肝细胞 LO2、人脐带来源间充质干细胞(hUCMSC)由胚胎干细胞研究湖北省重点实验室保存;MEM、DMEM、胎牛血清(FBS)购自 Gibco公司;对乙酰氨基酚(APAP)购自 MCE 公司;链霉素青霉素、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或山羊抗小鼠 IgG(H+L)、胰酶、IPA 裂解液、Annexin VFITC/PI 试剂盒购自碧云天生物技术公司;VEX Ex-osome Isolation eagent、100 bp DNA ladder 购 自Vazyme 公司;MEGAscript T7 试剂盒、
13、mNA 纯化试剂盒购自 Invitrogen 公司;TransITmNA 试剂盒购自 Mirus 公司;30Mem7G(5)ppp(5)G ACAcap analog 购自 NEB 公司;5甲基胞苷、假尿苷购自TriLink 公司;T4 DNA Ligase、质粒小提试剂盒、PC产物纯化试剂盒购自天根生化技术有限公司;AL、CD9、CD63、CD81、TSG101、Bcl2、Bax、Cleaved caspase3 抗体购自 Proteintech 公司。12实验方法121外泌体的提取hUCMSCs 添加 MEM+10%FBS+链霉素青霉素培养基,37、5%CO2培养箱培养至密度为 80%左右
14、时,PBS 洗 3 遍,更换成用去除外泌体的 FBS 配制的培养基继续培养 24 h,48 h 收集上清。上清用 022 m 的滤膜过滤除去细胞碎片后,4、3000 r/min 离心 20 min 取上清,加入 1/3 体积的 VEX Exosome Isolation eagent 试剂颠倒混匀 4 过夜后,4、10 000 r/min 离心 30min,弃去上清。沉淀即为外泌体,加入 PBS 重悬沉淀 BCA 法测定其浓度,放入80 冰箱中保存备用。122AL15 mNA 载体的构建及体外合成 mNA的纯化LO2细胞提取 NA 反转录成 cDNA,以cDNA 为模板扩增带酶切位点的 AL1
15、5 的全长序列,AL15 的全长序列和 pcDNA34 质粒酶切后胶回收目的片段,T4 连接酶连接,转入 DH5 感受态细胞,挑单菌落通过 PC、酶切、测序鉴定。以鉴定正确 AL15 mNA 质粒为模板,Tail PC 扩增得到含有多聚 A 尾的 AL15 DNA 片段,按 MEGAscriptT7 试剂盒的说明书和前期发表文献的方法体外合成 mNA10,并利用 mNA 纯化试剂盒纯化,测定浓度后80 保存。123体外合成 AL15 mNA 的转染LO2细胞培养至70%80%汇合时,按 TransITmNA 试剂说明书步骤转染体外合成的 AL15 mNA。100 LOptiMEM 优化培养基中
16、加入 1 g AL15 mNA,再依次加入 1 L TransITmNA 和1 L BOOST re-agent,轻轻混匀,室温放置 25 min。将混合物加入细胞培养液中,轻轻摇匀,37、5%CO2培养箱中培养。24 h 后收集细胞 Western Blot 检测 AL 的表达。124APAP 对肝细胞活力的影响将处于对数生长期 的 LO2细胞接种于 96 孔板中,每孔接种的细胞数量为 1104个,然 后 用 不 同 浓 度(0、4、8、12、16 mmol/L)的 APAP 处量 LO2细胞 24 h,加入831湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet
17、2023 年 4 月,42(2)CCK8 工作液 10 L,37 继续 孵 育 2 h,使用酶标仪于波长 450 nm 处检测各孔吸光度,实验重复 3次。125MSCExos 联合 AL15 mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响LO2细胞培养至密度为 70%左右时,向培养基中加入 8 mmol/L APAP 溶液处理4 h 后,分别加入 100 g/mL MSCExos 或加入 MSCExos 的同时按 TransITmNA 试剂盒说明书的步骤转染 25 mg/L AL15 mNA 后继续培养 24 h,按Annexin VFITC/PI 试剂盒说明书处理细胞,荧光显微镜拍照或流式细胞
18、仪检测细胞凋亡。126Western BlotMSCExos 加入蛋白裂解液裂解 30 min,4、12 000 r/m 离心 10 min 收集上清。加入 SDS Loading Buffer 混匀 98 煮沸 10min,冷却后 SDSPAGE 凝胶电泳转膜,5%脱脂牛奶封闭 1 h 后分别加入按 1 1000 稀释的 CD9、CD63、CD81、TSG101,4 孵育过夜,PBS 洗 3 遍,加入辣根过氧化物酶(HP)耦联的二抗 37 孵育 1h,PBS 洗 3 遍,加入 HP 超敏化学发光试剂显色拍照。按“124”中细胞分组处理的方式处理细胞后按上述方法检测凋亡相关蛋白 Bcl2、Ba
19、x、Cleavedcaspase3 的表达。2结果21MSCExos 的提取及鉴定采用 Western Blot 检测提取的 MSCExos 中外泌体特异性标记物的表达情况,结果显示提取的MSCExos 可表达 CD9、CD63、CD81、TSG101 这些外泌体特有的分子标记物(图 1A)。利用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测提取的 MSCExos 粒径大小,结果显示这些纳米颗粒的直径主要分布在 100200 nm 之间,与外泌体粒径大小相符(图 1B)。并进一步采用透射电子显微镜观察提取的 MSCExos的形态,结果如图 1C 所示,颗粒具有典型的囊膜结构。以上结果表明,已成功提取获得外泌
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