间歇禁食法在改善奥氮平诱导小鼠代谢紊乱中的机制研究_李晗.pdf
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1、DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.089实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineFeb.2023,43(1)张成芳,同济大学在读博士研究生,同济大学附属精神卫生中心主治医师,同济大学医学院及上海健康医学院兼职教师。临床业务方面,擅长老年期精神障碍、躯体疾病伴发精神障碍的诊治,以及精神药理学的临床运用。教学方面,获第一届同济大学医学院思政教学设计大赛二等奖、优秀思政案例奖,获2022年同济大学医学与生命科学课程思政教研分中心课程思政教学设计大赛优秀思政案例奖。科研方面,主要从事精神药理学基础研究,
2、尤其是动物模型构建和抗精神病药物代谢不良反应的机制探讨和临床防治研究。参与上海市科委、国家自然科学基金等多个科研项目,以第一作者及通信作者身份发表科研论文7篇,其中2018年以共同第一作者身份在Journal of Clinical Investigation期刊发表的研究论文首次报告了巨噬细胞迁移抑制因子在抗精神病药诱导的代谢紊乱中的作用及机制。2019年被列入上海市浦东新区优秀青年医学人才培养计划。李 晗,上海交通大学医学院附属精神卫生中心、上海市重性精神病重点实验室助理研究员,主要从事实验动物行为学平台管理,参与上海市科委、国家自然科学基金等多个科研项目,以(并列)第一作者及通信作者在F
3、rontiers in Cellular Neuroscience等杂志上发表科研论文3篇。间歇禁食法在改善奥氮平诱导小鼠代谢紊乱中的机制研究李 晗1,张笑瑞2,张成芳3(1.上海交通大学医学院附属精神卫生中心,上海市重性精神病重点实验室,上海201108;2.中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台,上海 200031;3.同济大学附属精神卫生中心,上海市浦东新区精神卫生中心,同济大学精神疾病临床研究中心,上海 200124)摘要 目的探究间歇禁食(intermittent fasting,IF)对奥氮平诱导小鼠代谢紊乱的保护作用及其机制。方法将 C57BL/6J 小鼠随机分为 4
4、 组:生理盐水+自由摄食组(Saline+Ad libitum)、生理盐水+间歇禁食组(Saline+IF)、奥氮平给药+自由摄食组(Olanzapine+Ad libitum)、奥氮平给药+间歇禁食组(Olanzapine+IF),每组8只。其中间歇禁食组采用52方案,即每周的周一、周四禁食,其余时间自由摄食,干预12周;以自由摄食作为间歇禁食的对照(Control),以生理盐水灌胃作为奥氮平给药的对照(Saline)。比较奥氮平处理组与对照组经过间歇禁食干预后小鼠体质量、肝脏质量和附睾旁脂肪组织质量的差异,并分别采用磁共振和HE染色法分析小鼠体脂、瘦素以及内脏脂肪浸润的变化;同时,分别采用
5、葡萄糖氧化酶法和放射免疫法测定小鼠糖代谢过程中空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的水平差异,分别采用ELISA和实时荧光定量PCR法测定H2O2含量和线粒体损伤相关标志物细胞色素C(Cytochrome C)mRNA水平。结果分组处理12周后,奥氮平诱导小鼠体质量、体脂、瘦素和内脏脂肪浸润明显增加(P0.05),空腹血糖、胰岛素和胰岛素指数也明显增加(P0.05);然而间歇禁食可以使上述指标明显降低(P0.05)。进一步研究表明:间歇禁食处理后小鼠脂肪组织部位的H2O2释放和Cytochrome C mRNA表达水平均明显降低(P0.05)。结论间歇禁食可以减轻奥氮平引起的小鼠
6、代谢紊乱,其机制可能与抑制氧化应激水平和维持线粒体功能有关。关键词 间歇禁食法;肥胖;氧化应激;线粒体;C57BL/6J小鼠中图分类号 Q95-33;R-332 文献标志码 A 文章编号 1674-5817(2023)01-0003-08 人类疾病动物模型:药学专题 Animal Model of Human Disease:Pharmacology基金项目 上海市浦东新区优秀青年医学人才培养计划(PWRq2020-19);上海市浦东新区科技发展基金(民生科研专项:医药卫生)“间歇限制热量法在奥氮平诱导的胰岛素抵抗小鼠模型中的作用”(PKJ2018-Y27)第一作者 李 晗(1984),男,硕
7、士,助理研究员,研究方向:精神疾病模型研究。E-mail:。ORCID:0000-0003-3903-5254通信作者 张成芳(1987),女,博士研究生,主治医师,研究方向:抗精神病药物代谢不良反应的机制和临床防治。E-mail:。ORCID:0000-0002-5977-03123实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineFeb.2023,43(1)Mechanism of Intermittent Fasting in Improving Olanzapine-induced Metabolic Disorders in Mi
8、ceLI Han1,ZHANG Xiaorui2,ZHANG Chengfang3(1.Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiao Tong University of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Psychotic Disorders,Shanghai 201108,China;2.Animal Core Facility of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai
9、200031,China;3.Clinical Research Center for Mental Disorders,Shanghai Pudong New Area Mental Health Center,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200124,China)Correspondence to:ZHANG Chengfang(ORCID:0000-0002-5977-0312),E-mail:ABSTRACT Objective To explore the beneficial role and potential me
10、chanism of intermittent fasting in olanzapine-induced metabolic disorders.Methods C57BL/6J mice were randomly divided into four groups:Saline+ad libitum(Saline+Ad libitum),Saline+intermittent fasting(Saline+IF),olanzapine administration+ad libitum(Olanzapine+Ad libitum),and olanzapine administration
11、+intermittent fasting(Olanzapine+IF),with eight mice in each group.The IF group adopted the 5 2 scheme,that is,fasting on Monday and Thursday every week,and eating freely in the rest of the time.Ad libitum feeding as the control of intermittent fasting,Saline gavage as the control of olanzapine admi
12、nistration.The experiment lasted for 12 weeks.The differences of body mass,liver mass and epididymal adipose tissue mass were compared between the olanzapine-treated group and the control group after IF intervention.The body fat mass,lean body mass,and visceral fat infiltration of mice were analyzed
13、 by nuclear magnetic resonance and HE staining,respectively.Furthermore,the levels of fasting blood glucose,insulin,and insulin resistance index(HOMA-IR)in the process of glucose metabolism were also measured by glucose oxidase method and radioimmunoassay,respectively.The effects of IF on H2O2 relea
14、se and the level of cytochrome C mRNA,a marker related to mitochondrial damage,were detected by ELISA and real-time fluorescence quantitative PCR.Results After 12 weeks of treatment,olanzapine induced a significant increase in body mass,body fat,lean body mass and visceral fat infiltration(P0.05),as
15、 well as fasting blood glucose,insulin,and HOMA-IR(P0.05);however,IF significantly reduced the above indicators(P0.05).Further studies showed that the release of H2O2 and the expression of Cytochrome C mRNA in adipose tissue of mice after intermittent fasting treatment were significantly decreased(P
16、0.05).Conclusion Intermittent fasting therapy can alleviate olanzapine-induced metabolic disorders in mice.The underlying mechanism may involve the inhibition of oxidative stress level and the maintenance of mitochondrial functions.Key words Intermittent fasting therapy;Obesity;Oxidative stress;Mito
17、chondria;C57BL/6J mice精神分裂症是一种严重的慢性障碍疾病。流行病学调查表明,高达 1%的人群饱受精神分裂症的折磨1。目前,精神分裂症的病因机制尚未明确,临床治疗手段有限,主要是使用第二代抗精神药物奥氮平。奥氮平因其良好的治疗效果,可以显著改善阴性症状和认知障碍,成为临床治疗精神分裂症的一线用药2。长期使用奥氮平虽然可以改善精神分裂症状,但是也显著加剧机体的脂质代谢和炎性反应,使患者出现肥胖等症状,罹患心血管疾病和糖尿病的风险骤然增加3。遗憾的是,目前临床上缺乏有效的药物干预奥氮平诱导的不良反应,相关的致病机制研究仍然较少。以往研究表明,心血管疾病和糖尿病均与炎症小体释放增
18、加、炎性反应激活、能量代谢异常以及氧化应激密切相关4。炎症小体是经典的炎性代谢感受器,负责感知多种病原体和损伤相关信号通路的变化5。在糖尿病模型中,负责炎性因子调节的促炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1 和 IL-18 介导caspase-1活化,促进氧化应激,导致细胞死亡以及糖尿病和心血管系统的炎性反应6。为了响应炎性刺激反应,炎症小体也会募集和重新分配能量代谢,以满足细胞在炎性状态下的能量稳态7-8。此外,能量代谢产生的琥珀酸等小分子物质可以促进线粒体琥珀酸氧化和线粒体膜电位升高,共同驱动线粒体活性氧4实验动物与比较医学 Laboratory Animal and C
19、omparative MedicineFeb.2023,43(1)(reactive oxygen species,ROS)的产生,进一步加剧线粒体ROS水平升高9。间歇禁食是近年来的研究热点之一,其包括通过短期禁食或限制热量来控制进食,达到改善机体结构和整体健康的一系列方式,其本质不是减少总能量摄入,而是通过改变进食时机达到改善代谢紊乱的目的。研究最广泛的3种间歇禁食方案是隔日禁食、52方案(每周有间隔开的2 d禁食或极低热量饮食,其余时间自由摄食)和每日限时饮食,其中52方案因对热量限制较低,成为最流行的方案10。一般认为,通过间歇禁食可以有效抑制体质量增加、降低促炎因子浓度、减少代谢紊乱
20、,预防和治疗心血管疾病和代谢性疾病。因而,通过调节饮食方式降低炎性反应的策略受到极大关注。在大鼠高脂饮食模型的研究中,间歇禁食通过调节炎性反应,显著降低了胰岛素、血糖和胰岛素抵抗水平11。此外,间歇禁食能够调节线粒体活性和氧化应激水平。本研究以线粒体和氧化应激为切入点,通过间歇禁食研究奥氮平诱导肥胖与氧化应激的关系,进一步揭示间歇禁食调节奥氮平诱导肥胖的机制,为临床干预奥氮平的不良反应提供理论基础。1材料与方法1.1实验动物SPF级雄性C57BL/6J小鼠32只,8周龄,体质量2022 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司SCXK(沪)2021-0007。小鼠饲养于上海睿太莫斯生物科技有限公司实
21、验动物屏障设施 SYXK(沪)2018-0007,温度2225,相对湿度40%70%,12 h日夜交替照明。本研究项目中动物实验方案经上海睿太莫斯生物科技有限公司的实验动物使用与管理委员会审核批准(SHRTMOBIO-IACUC-PR01-20211115)。1.2主要仪器和试剂奥氮平(美国 Sigma 公司),血糖仪、血糖试纸(德国拜耳公司),H2O2 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),苏木素伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),戊巴比妥钠粉末(美国Sigma公司)。TRIzol试剂和引物合成(美国 Invitrogen 公司),
22、反转录和实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),实时荧光定量PCR仪(美国Abbott公司,型号:m2000rt)。1.3实验分组及小鼠体质量监测将C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水+自由摄食组(Saline+Ad libitum)、生理盐水+间歇禁食组(Saline+IF)、奥 氮 平 给 药+自 由 摄 食 组(Olanzapine+Ad libitum)、奥氮平给药+间歇禁食组(Olanzapine+IF),每组8只。奥氮平给药+自由摄食组,按每天3 mg/kg的剂量12灌胃奥氮平溶液,自由摄食;奥氮平给药+间歇禁食组在给予奥氮平处理的同时,每周2 d(周一、周四)禁食;生理
23、盐水+自由摄食组,每天灌胃同等体积的生理盐水(即0.9%NaCl溶液),自由摄食;生理盐水+间歇禁食组,每天灌胃同等体积的生理盐水,每周2 d(周一、周四)禁食。预实验发现建模12周,代谢表型比较稳定;而且临床上针对奥氮平引起代谢紊乱的干预性研究周期多为12周。因此,本实验周期为12周,每周定时称量小鼠体质量。1.4样本收集建模12周后,小鼠禁食12 h,按40 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,将小鼠固定于操作台上,消毒后解剖打开腹腔,收集肝脏及附睾旁脂肪组织,分别称肝脏质量、脂肪质量。收集的肝脏组织和脂肪组织一部分用于组织病理切片;另一部分经液氮速冻后转80 保存,待测脂肪组织中基因
24、表达水平。1.5胰岛素抵抗水平测定建模12周后,小鼠禁食12 h,按40 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,经髂静脉取血;用肝素抗凝管留取血液标本,离心20 min(2 500 r/min),收集血浆。采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖,放射免疫法检测空腹胰岛素。计算胰岛素抵抗的稳态模型评估(homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)指数=空腹血糖(mmol/L)空腹胰岛素(mU/L)/22.5。1.6小鼠身体组成成分分析建模 12 周后,用 EchoMRI-100 磁共振仪(美国Echo Medical Syste
25、m公司)分析小鼠附睾旁脂肪组织的脂肪及瘦素含量。1.7肝脏和脂肪组织染色将收集到的小鼠肝脏组织和附睾旁脂肪组织置于质量分数为4%的多聚甲醛溶液中固定48 h,常规石蜡包埋后切片(34 m),然后进行HE染色。光学显微镜下观察肝脏组织和脂肪组织的病理改变,以细胞体积变化反映脂肪浸润程度。1.8ELISA检测H2O2含量脂肪组织匀浆后收集上清液,用ELISA试剂盒检测H2O2含量。按照试剂盒操作流程,依次配制标准品,加入样本上清液,再加入试剂和显色试剂等,酶标仪检测吸光度(A)值,依次计算样本H2O2含量。5实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative M
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