基于生物信息学筛选Tlr4基因用于诊断外周动脉疾病_王阳.pdf
《基于生物信息学筛选Tlr4基因用于诊断外周动脉疾病_王阳.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基于生物信息学筛选Tlr4基因用于诊断外周动脉疾病_王阳.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、4期外周动脉疾病(peripheral artery disease,PAD)是一种动脉粥样硬化病变,主要累及下肢动脉,可引发管腔狭窄和闭塞。PAD 影响全球约 2 亿人1,在 60 岁及以上人群中发病率为 12%20%2,在 85 岁及以上人群中这一比例已升至 50%3。PAD 会导致肢体严重缺血,进而引起静息性疼痛、趾端坏疽甚至截肢4。患者的症状、体征和超声多普勒检查是目前诊断 PAD 的主要方法5,但具有典型征象的 PAD 患者只有 10%6。随着基因测序、微阵列和蛋白质组学在内的生物信息学的快速发展,生物信息学已被应用于癌症、呼吸系统、神经系统、心血管系统等各个医学领域7-11。本研究
2、利用生物信息学方法从 GEO 数据库中对比小鼠正常下肢肌肉组织与小鼠缺血下肢肌肉组织的基因表达差异,发现枢纽基因,进而探求该枢纽基因与 PAD 的关系。1材料与方法1.1利用生物信息学方法发现枢纽基因本研究从公共高通量基因表达资源库(GEO)中下载 GSE3313 微阵列数据集,GSE3313 中包含了小鼠术前(股动脉结扎离断术)下肢肌肉组织样本及术后 3 个不同时间点(术后 1 d、术后 7 d和术后 14 d)的肌肉组织样本,对每个样本采用3 个独立的重复实验12,采用两组间基因表达量比值 FC(fold change)来描述差异显著性情况。通过 GEO2R 从数据集中筛选出差异表达基因(
3、DEGs)13,筛选条件:同时满足 log2FC1 或-1和错误发现率(FDR)2,截断值=2,节点截断值=0.2,最大深度=100,k 评分=2)。1.2小鼠下肢缺血模型构建BALB/c 野生型裸鼠(雌性 18 只,810 周)购自宁夏医科大学实验动物中心。使用异氟烷诱导麻收稿日期:2022-07-07基金项目:国家自然科学基金项目(81860056);宁夏自然科学基金项目(2020AAC03350)作者简介:王阳(1982),男,在读硕士研究生,主治医师。E-mail:通信作者:刘丹妮,女,博士,主任医师,硕士研究生导师。E-mail:基于生物信息学筛选 Tlr4 基因用于诊断外周动脉疾病
4、王阳1,李沛玲2,张永海1,2,巩凡2,杨梦渠1,2,刘丹妮2(1.宁夏医科大学,银川750004;2.宁夏回族自治区人民医院,银川750002)摘要:目的利用生物信息学方法筛选出与外周动脉疾病(PAD)密切相关的枢纽基因,探求该基因与 PAD 的关系,从而寻求诊断 PAD 的新方法。方法分析来自基因表达综合数据库(GEO)的小鼠下肢肌肉组织数据集GSE3313,找到差异表达基因(DEGs)。对 DEGs 进行基因本体论(GO)富集分析,京都基因、基因组百科全书(KEGG)分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析。利用 Cytoscape 软件的分子复合物检测插件(MCODE)和 cytoH
5、ubba 插件发现枢纽基因。建立小鼠下肢缺血模型,根据术后 1 d 下肢血流再灌注率将小鼠分为正常组及轻、中、重度缺血组。用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、Western blot 及免疫荧光染色在各组中检测该枢纽基因。结果在 Cytoscape 软件的 MCODE 插件算法中,Toll 样受体 4(Tlr4)处于得分最高团簇。在Cytoscape 软件的 cytoHubba 插件算法中,Tlr4 得分在所有 DEGs 中排名第 1。qPCR 结果显示,重度缺血组中Tlr4 基因相对表达量均高于轻、中度缺血组及正常组(P 均0.01)。Western blot 结果显示,Tlr4 蛋白
6、含量从正常组到重度缺血组逐渐增加(P 均0.05)。免疫荧光染色显示,Tlr4 的表达水平从正常组到重度缺血组逐渐升高(P 均70%)、中度缺血组(40%70%)、重度缺血组(40%),每组 6 只,每只小鼠的右侧下肢作为正常组。实验获得宁夏医科大学动物伦理委员会批准(IACUC-NYLAC-2020-169)。1.3实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)从各组小鼠缺血下肢肌肉组织中提取总RNA。采用 ABScript 3 RT Master Mix for qPCRwith gDNA Remover(RK20429,ABclonal,中国)试剂,经 PCR 仪(T100 Thermal Cy
7、cler,BIO-RAD,美国)逆转录为 cDNA。采用 Universal SYBR GreenFast qPCR Mix(RK21203,ABclonal,中国)试剂,经 SYBRGreen 1 嵌合荧光法在 CFX96 Real-Time System(C1000 Touch Thermal Cycler,BIO-RAD,美国)上检测Tlr4基因表达水平。Tlr4引物序列Forward:TTCAGAACTTCAGTGGCTGG,Reverse:TGTTAGTCCAGAGAAACTTCCTG。采用比较周期阈值(Ct)法检测基因表达,通过 2Ct计算各组Tlr4 基因相对表达量。1.4Wes
8、tern blot分别提取正常组、轻度缺血组、中度缺血组、重度缺血组小鼠的下肢肌肉组织蛋白,BCA 法测定总蛋白含量。各组按每 10 L 含 20 g 蛋白体系加入适量 5SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液及无菌水,使各组间达到等体积等蛋白含量。将混合物煮沸 5 min,每组取 10 L 混合物加入 8%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行分离。再将印迹转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,快速封闭液封闭 15 min。加入稀释比例为 11 000 Tlr4 抗体(A11226,ABclonal,中国)及稀释比例为 12 000-actin 内参抗体(AC026,ABclonal,中国),4 C 孵育过夜。使
9、用二抗稀释比例为 14 000 HRP Goat Anti-RabbitIgG(AS014,ABclonal,中国)孵育 1 h,最后用发光液进行曝光。采用 Image J 软件进行数据分析。1.5免疫荧光染色将不同缺血程度的小鼠下肢组织浸入 OCT包埋剂(Sakura Finetek,日本),再转至-80 冰箱冷冻至固态。将组织包埋块切为 5 m 薄片后制成玻片,加入稀释比例为1100Tlr4 抗体(A11226,ABclonal,中国),4 C 孵育过夜;再加入驴抗兔稀释比例为 1400 IgG H&L 二抗(ab150075,Abcam,英国)及 DAPI 染色剂(S2110 Solar
10、lio,中国)。用倒置荧光显微镜(Zeiss,Oberkochen,德国)拍照,选取每张组织玻片的 3 个随机区域,使用 Image J 软件对阳性区域进行量化。1.6统计学方法采用 SPSS 26.0 与 GraphPad Prism 9 软件进行数据分析,计量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1DEGs 的筛选使用火山图描绘不同组之间的 DEGs,根据DEGs 的筛选标准,术后 1、7、14 d 组与术前组相比分别有 1 055、7 098 和 5 952 个 DEGs(图 1A);使用
11、韦恩图发现了 3 个比较组的 DEGs 中有 368个共同基因(图 1B);最后利用聚类热图对共同基因的表达情况进行描绘(图 1C)。2.2KEGG 和 GO 功能分析KEGG 分析发现,Tlr4 信号通路和先天免疫反应正向调节通路是 DEGs 的关键信号通路(图2A)。GO 富集分析提示 DEGs 主要存在于细胞膜和细胞核中,其主要分子功能是进行蛋白质结合与离子结合,主要参与生物调控、代谢进程和刺激应答的生物过程(图 2B)。将 DEGs 的 GO 富集结果(图 2C)展示为气泡图,x 轴表示富集率,y轴表示 GO 富集名称,圆圈的大小表示 DEGs 基因的数量,圆圈的色调表示调整后的 P
12、值(-Log10P value)(图 2D)。2.3PPI 网络与 Cytoscape 软件分析剔除无关联的 188 个基因后,PPI 网络包含180 个节点和 268 条边(图 3A)。将 PPI 网络分析得到的基因导入 Cytoscape 软件,利用 MCODE 插件对各个基因团簇进行评分,得到排名前 5 的团簇分别为:6 分组包含 13 个节点和 36 条边,4.5分组包含 5 个节点和 9 条边,3.429 分组包含 8个节点和 12 条边,3 分组包含 3 个节点和 3 条边,2.75 分组包含 9 个节点和 11 条边(图 3B)。根据 cytoHubba 插件的 degree 模
13、式确定得分前10 的基因,排名依次为 Tlr4、Ar、Lgf1、Hmgb2、Cebpb、Tbk1、Slc7a5、Cdt1、Exo1、Itpr1(图 3C)。其3884期中 Tlr4 处于得分最高的团簇中(6 分),同时 Tlr4也是 cytoHubba 插件的 degree 模式中排名第一的基因(15 分)。因此选择 Tlr4 作为关键枢纽基因进行研究。首先比较 4 组基因芯片中 Tlr4 的绝对表达量,数据显示 Tlr4 峰值出现在术后 1 d(图 3D),因此以术后 1 d 作为研究时间点。2.4建立小鼠下肢缺血模型采用激光散斑分析仪评估术前及术后 1 d小鼠下肢血流,结果见图 4。2.5
14、qPCRqPCR 结果显示,重度缺血组的 Tlr4 基因相对表达量均高于中度缺血组、轻度缺血组及正常组(P 均0.01),见图 5。2.6Western blot结果显示,重度缺血组 Tlr4 蛋白表达量高于中度缺血组、轻度缺血组和正常组(P 均0.01),中度缺血组 Tlr4 蛋白表达量高于正常组与轻度缺血组(P 均0.05),轻度缺血组 Tlr4 蛋白表达量高于正常组(P0.05),见图 6A、图 6B。2.7免疫荧光染色定量结果显示,重度缺血组 Tlr4 含量高于中度缺血组、轻度缺血组和正常组(P 均0.01),中度缺血组 Tlr4 含量高于正常组与轻度缺血组(P均0.05),轻度缺血组
15、 Tlr4 含量高于正常组(P0.05),见图 7。3讨论本研究应用生物信息学方法,筛选出 PADA:术后 1、7、14 d 组分别与术前组比较的火山图(红点为上调基因,绿点为下调基因,黑点为无表达差异基因);B:韦恩图;C:3 组共同的 368 个基因的聚类热图。图 1DEGs 的火山图、韦恩图及聚类热图A:KEGG 富集分析;:GO;C:GO 富集结果;D:GO 富集气泡图。图 2DEGs 的 GO 和 KEGG 分析1 d 组 vs 术前组7 d 组 vs 术前组14 d 组 vs 术前组log2(Fold-Change)log2(Fold-Change)log2(Fold-Change
16、)-log10(P.value)2.52.01.51.00.50.0-10-8-6-4-20246810-10-8-6-4-20246810-10-8-6-4-20246810-log10(P.value)2.52.01.51.00.50.0-log10(P.value)2.52.01.51.00.50.02 4754 1201 410498368541356420241 d7 d14 dFDR0.05FDR0.05ACBABCD王阳,等.基于生物信息学筛选Tlr4基因用于诊断外周动脉疾病389宁夏医科大学学报45卷A:PPI 网络图;B:排名前 5 的基因团簇;C:基因得分排名;D:Tlr4
17、 基因在各组中绝对表达量;与术前组比较*P0.05。图 3PPI 网络及 Cytoscape 软件分析结果图 4采用激光散斑分析仪评估术前及术后 1 d 小鼠下肢血流关键枢纽基因 Tlr4,随后建立小鼠下肢缺血模型,使用 qPCR、Western blot 及免疫荧光染色检测各组 Tlr4 表达情况。结果显示,与正常组相比,缺血组 Tlr4 表达量增加,其表达水平与下肢缺血严重程度呈正相关。因此,Tlr4 基因可作为潜在生物标记物用于 PAD 诊断。Toll 样受体是一种非特异性免疫蛋白,在病原体识别和先天免疫激活中起重要作用。在 Toll样受体不同的亚型中,Tlr4 参与了 PAD 的炎性反
18、应。Tlr4 通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路激活转录因子,导致多种促炎因子合成,诱导氧自由基的产轻度缺血组中度缺血组重度缺血组术前术后 1 d*100806040200Tlr4 基因相对表达量正常组轻度缺血组中度缺血组重度缺血组*P0.01。图 5Tlr4 基因在各组中的相对表达量*术前组术后 1 d 组术后 7 d 组术后 14 d 组6004002000Tlr4 基因绝对表达量(拷贝数)Cytoscape 软件评分/分181614121086420Tlr4ArLgf1Hmgb2CebpbTbk1Slc7a5Cdt1E
19、xo1Itpr1ABCD3904期A:Tlr4 在各组中表达情况的免疫荧光图(红色:Tlr4,蓝色:DAPI,bar:200 m);B:免疫荧光定量图;*P0.05,*P0.01。图 7Tlr4 在各组中的免疫荧光染色情况生,加速调亡过程,从而加重下肢缺血及组织坏死19。Tlr4 还可以经活化 B 细胞核因子 kappa-轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancerof activated B cells,NF-B)通路,激活 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain
20、 associated protein 3,NLRP3)炎症小体,进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)与白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1),活化的 Caspase-1 能够裂解 GSDMD(gasdermin D),导致细胞膜形成孔隙,引起细胞焦亡,同时,释放出的 IL-1 刺激炎性细胞,促发炎性级联反应,加重下肢缺血。在下肢缺血组织中存在一种特殊的炎性细胞巨噬细胞,它具有两种表型,M1 型能够加速炎性过程,起到促炎作用;M2 型具有促进血管新生、抑制炎性等作用。下肢缺血坏死后,细胞碎片、基质降解产物可以经 Tlr4 受体激活 NLRP3 炎症小体通路,
21、使组织间隙的 IL-1 增多从而诱导巨噬细胞向 M1表型极化,在加重 PAD 炎性反应过程中起关键作用20。综上所述,Tlr4 与 PAD 关系密切,Tlr4 可以通过炎性级联反应、调节局部免疫、影响血管新生等多种途径参与 PAD 的发生、发展,因此Tlr4 在 PAD 诊断中具有重要意义,同时 Tlr4 基因也是治疗 PAD 疾病的潜在靶点。在本实验中只有一个数据集被使用,同时仅创建了小鼠下肢缺血模型进行研究,对 Tlr4 与PAD 之间的确切联系并无临床实验数据支持。为了评估 Tlr4 基因在诊断 PAD 中的应用价值,需要进行大规模的数据挖掘和临床实验。参考文献:1 Shu J,Sant
22、ulli G.Update on peripheral artery disease:Epidemiology and evidence-based facts J.Atherosclerosis,2018,275:379-381.2 Firnhaber JM,Powell CS.Lower extremity peripheralartery disease:diagnosis and treatment J.Am FamPhysician,2019,99(6):362-369.3 Benjamin EJ,Virani SS,Callaway CW,et al.Heartdisease an
23、d stroke statistics-2018 update:a report fromthe american heart association J .Circulation.,2018,137(12):67-492.4 Ungerleider L,Christman KL.Concise review:injectablebiomaterials for the treatment of myocardial infarctionA:Tlr4 蛋白在各组中的表达水平;B:Tlr4 蛋白在各组中的表达定量图;*P0.05,*P0.01。图 6Tlr4 蛋白在各组中的表达情况*正常组轻度缺
24、血组中度缺血组重度缺血组1086420Tlr4 阳性区域占比/*正常组轻度缺血组中度缺血组重度缺血组正常组轻度缺血组 中度缺血组 重度缺血组1.00.80.60.40.20.0Tlr4/-actin 蛋白表达量96 kDa42 kDaTlr4-actinAB正常组重度缺血组轻度缺血组中度缺血组AB王阳,等.基于生物信息学筛选Tlr4基因用于诊断外周动脉疾病391宁夏医科大学学报45卷Bioinformatics-based Screening of Tlr4 Gene for Diagnosis of PeripheralArtery DiseaseWANG Yang1,LI Peiling2
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基于 生物 信息学 筛选 Tlr4 基因 用于 诊断 动脉 疾病 王阳
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。