凡纳滨对虾小型温棚养殖模式水体微生物群落的研究_方圆.pdf
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1、DOI:10.12131/20220205文章编号:2095 0780(2023)03 0029 13凡纳滨对虾小型温棚养殖模式水体微生物群落的研究方 圆1,2,黎 慧1,王李宝1,万夕和1,史文军1,杨泽禹1,姜 琦1,沈 辉1,胡润豪1,管小平3,杨家新21.江苏省海洋水产研究所,江苏 南通 2260072.南京师范大学 海洋科学与工程学院,江苏 南京 2100233.伊犁悦然生态农业有限公司,新疆 伊犁 835399摘要:小型温棚养殖模式(下称小棚模式)是近年来凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖的热点模式。为阐明小棚模式养殖水体微生物群落的特点,探究该模式高产、高
2、效的原因,基于16S rRNA基因的测序结果,对第2、第44、第69和第96天小棚模式养殖水体的微生物群落组成和功能进行了分析。结果表明:凡纳滨对虾小棚养殖后期,水体微生物群落的丰富度和多样性显著高于前期;在整个养殖过程中,门水平主要优势菌为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门,其中变形菌门丰度在第69天显著增加,放线菌门丰度前期较高,后期下降;属水平优势菌属中Candidatus_Aquiluna的丰度在第2天最高(28.7%);海命菌属(Marivita)在中期富集,在第69天丰度最高(9.94%);黄杆菌属(Flavobacterium)的丰度随着养殖时间逐渐增加,在第96天达到最高(11.63
3、%)。通过PICRUS t2 预测微生物群落的功能,丰度前20的代谢功能项在第69和第96天的丰度显著高于第2天,尤其萜类和聚酮类代谢、脂类代谢、异种生物降解和代谢等功能均高度富集,通过FAPROTAX鉴定得出,化能异养类菌的丰度在养殖后期显著增加。环境因子关联分析发现,总氮(TN)和化学需氧量(COD)对小棚模式水体微生物群落结构的影响最大,海命菌属、Candidatus_Aquiluna、红小梨形菌属(Rhodo-pirellula)等微生物发挥了固碳、降氮、降磷的作用。综上所述,在高密度、高氮磷的环境条件下,小棚模式的水体微生物在保持水环境稳定和增强对虾免疫与抗病能力方面发挥了重要作用。
4、关键词:小型温棚模式;凡纳滨对虾;养殖水体;微生物群落;高通量测序中图分类号:S 917.1文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Study on bacterial community structure in rearing water in small green-house of Litopenaeus vannameiFANG Yuan1,2,LI Hui1,WANG Libao1,WAN Xihe1,SHI Wenjun1,YANG Zeyu1,JIANG Qi1,SHEN Hui1,HU Runhao1,GUAN Xiaoping3,YANG Jiaxin21.
5、Jiangsu Marine Fisheries Research Institute,Nantong 226007,China2.College of Marine Science and Engineering,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China3.Yili Yueran Ecological Agriculture Co.Ltd.,Yili 835399,ChinaAbstract:In recent years,small greenhouse has been a hot model of Litopenaeus vannam
6、ei culture.In order to elucidate the第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19,No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.,2023收稿日期:2022-07-25;修回日期:2022-12-14基金项目:江苏现代农业(特色水产)产业技术体系(JATS2022419);2021 年度省政策引导类计划(苏北科技专项-富民强县)(SZ-YC202114);江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(21)3160);新疆维吾尔自治区乡村振兴产业发展科技行动项目(2022NC019);2022 年江苏沿海开
7、发集团有限公司科研项目(2022YHNFZZ01)作者简介:方圆(1996),男,硕士研究生,研究方向为水产健康养殖及微生物。E-mail:通信作者:黎慧(1985),女,副研究员,硕士,研究方向为水产健康养殖及病害防控。E-mail:万夕和(1971),男,研究员,博士,研究方向为水产健康养殖及病害防控。E-mail:structure and changes of the microbial community in the rearing water of L.vannamei culture in small greenhouse and explorethe reasons for
8、high yield and high efficiency of this model,we analyzed the composition and function of the microbial com-munity on 2nd,44th,69th and 96th day of water in the small greenhouse based on 16S rRNA sequencing results.The re-sults show that the richness and diversity of water microbial community at late
9、 stage of small greenhouse were significantly high-er than those at early stage.During the whole culture process,the dominant bacteria at the phylum level were Proteobacteria,Bacteroidetes and Actinobacteria,among which the abundance of Proteobacteria increased significantly on 69th day,and theabund
10、ance of Actinobacteria increased at early stage but decreased at later stage.At genus level,the abundance ofCandidatus_Aquiluna was the highest on 2nd day(28.7%).Marivita was enriched at middle stage,with the highest abundance on69th day(9.94%).The abundance of Flavobacterium gradually increased wit
11、h the culture time,reaching the highest on 96th day(11.63%).PICRUSt2 predicts the function of the microbial communities,and the abundances of metabolic function in the top20 were significantly higher on 69th and 96th day than on 2nd day.In particular,the functions of terpenoids and polyketides meta-
12、bolism,lipid metabolism,xenobiotics biodegradation and metabolism were highly enriched.Through FAPROTAX identifying,the abundance of chemoheterotrophy increased significantly at the late stage.The correlation analysis of environmental factorsshows that total nitrogen(TN)and chemical oxygen demand(CO
13、D)had the greatest impacts on the microbial communitystructure in greenhouse model.Microorganisms such as Marivita,Candidatus_Aquiluna and Rhodopirellula played the roles insequestration of carbon and reduction of nitrogen and phosphorus.In conclusion,under the high density and high nitrogen andphos
14、phorus culture conditions,the water microbial community in the small greenhouse played an important role in maintain-ing the stability of water environment and enhancing the immunity and disease resistance of prawns.Keywords:Small greenhouse;Litopenaeus vannamei;Rearing water;Bacterial community str
15、ucture;Illumina high through-put sequencing凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)隶属对虾科、滨对虾属,又称南美白对虾,是国内集约化高产养殖的优良品种1,具有生长快、抗病力强、盐度适应广等优点2。随着凡纳滨对虾养殖业的蓬勃发展,出现了池塘养殖、温棚养殖、高位池养殖、工厂化养殖等多种养殖模式3。凡纳滨对虾小型温棚养殖模式(下文简称小棚模式),是温棚养殖的一种,具有占地小、养殖风险低、投资回报率高的特点,每年可养 23 茬,能反季节养殖与保温延后上市;单棚产量达 9001 250 kg,平均每棚每茬的效益可达万元4。该模式不使用抗生素或消毒
16、剂等,多使用以微生态制剂为主的水质改良剂5-6。因此,小棚模式成为近年来全国凡纳滨对虾养殖的热点模式。水产养殖环境中存在较高的细菌丰度。研究发现,凡纳滨对虾养殖水体中可培养细菌为 7.101048.40104 CFUmL17,这些细菌在有机物的转化和代谢方面发挥着重要作用8,如硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)等能加速残饵和粪便的分解9,黄杆菌(Flavobacteriaceae)等能将非离子氨、亚硝态氮、硫化氢等有毒物质转化为低毒性或无毒性的物质10,假单胞菌(Pseudomonas)等病原菌会导致养殖动物发病11。随着高通量测序技术的发展,扩增子测序
17、已被广泛用于对虾养殖的微生物群落相关研究12,变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门和放线菌门为水产养殖环境中的常见菌门13。由于凡纳滨对虾养殖水体、沉积物和虾肠道中的细菌群落结构存在显著差异14,微生物在环境中的作用是群落功能的一个潜在指标15,因此研究水产养殖环境微生物群落的多样性、物种组成及其功能,对提高养殖效率、减少病害发生、控制环境污染等有重要意义。目前有关小棚模式的报道主要集中在水质和养殖管理技术上16-17,而有关其水体微生物群落的研究尚未见报道。为填补这一空白,本研究利用 16SrRNA 测序,对小棚模式养殖水体微生物群落的组成和潜在功能进行研究,并比较了完整养殖周期内养殖水体微生物和水质
18、的变化,旨在阐明小棚模式养殖水体微生物群落的特点,探究该模式高产、高效的原因,为该模式养殖池塘水质管理和科学生产提供理论依据。1 材料与方法 1.1 样品采集与处理试验棚位于江苏省南通市如东县丰利镇光荣村凡纳滨对虾小棚养殖基地(1210549E,322924N),30南 方 水 产 科 学第 19 卷养殖总面积约 19 200 m2,每棚为长 39 m宽10 m,养殖期间水深 0.60.8 m。选择 2#棚作为试验棚,放苗时间为 2021 年 8 月 12 日,放苗密度约为 200 尾m3,2021 年 11 月 15 日养殖结束,养殖周期共 96 d。最终收获规格约为 65 尾kg1,产量约
19、为 800 kg,成活率约为 86.93%。养殖期间除正常投料、换水、监测水质外,还施用了含芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶菌酶的饲料添加剂并定期泼洒红糖水。自放苗第 2 天(8 月 13 日)起,每隔 8 d 采样1 次(遇天气、疫情、交通等特殊情况,适当延后12 d)。采样方法参照渔业生态环境监测规范(SC/T 9102.22007),于试验棚 3 个不同点位各取表层水样 5 L(图 1);现场使用哈希便携式水质分析仪(HQ40d)测定水温(T)、盐度(S)、pH、溶解氧(DO)。实验室测定样品的化学需氧量(COD)、悬浮物(SS)、总氮(TN)、总磷(TP)、氨氮(NH
20、4+-N)、亚硝态氮(NO2-N),其中 COD 测定参照水质高锰酸盐指数的测定(GB 1189289),SS、NH4+-N和 NO2-N 测定参照海洋监测规范第 4 部分:海水分析(GB 17378.42007),TN、TP 参照海洋监测技术规程(HY/T 147.12013)。水体样本在 4 h 内用 0.22 m 微孔滤膜过滤(直径 50 mm;上海新亚),滤膜于80 保存待测。根据水质测定结果,选择第 2、第 44、第69、第 96 天的微生物样本,分别用 GC1、GC2、GC3、GC4 表示,每组 3 个平行,共计 12 个样品,委托广州基迪奥生物科技有限公司(广州)测序。1.2 D
21、NA 提取与高通量测序环境微生物样本 DNA 用 HiPure Soil DNAKits 土壤 DNA 提取试剂盒(型号 D3142,广州美基生物科技有限公司)提取。用 Nanodrop 测定 DNA纯度,并将 DNA 浓度稀释至 100 ng L1,1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量,80 保存备用。用带有 barcode 的特异引物扩增 16S rDNA 的V3+V4 区。引物序列为:341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和 806R(GGACTACHVGGGTATCTAAT)。PCR 反应条件与反应体系按附录 A(详见 ht-tp:/dx.doi.org/10.12
22、131/20220205 的资源附件,后同)。使用 AMPure XP Beads 对扩增产物进行纯化,用 ABI StepOnePlus Real Time PCR System(LifeTechnologies,美国)进行定量,根据 Novaseq6000 的 PE 250 模式 pooling 上机测序。1.3 生物信息学分析扩增后样品基于 Illumina Hiseq 2500 平台(PE250)测序。根据引物的 Barcode 序列从下机数据中拆分出各样品测序数据,利用 FASTP(Version0.18.0)及 FLASH(Version 1.2.11)对数据进行过滤、拼接,并利用
23、数据库(Gold database)比对(UCHIME Algorithm)检测并去除嵌合体序列,利用 Mothur 软件包对 tag 序列进行去冗余处理,筛出 unique tag 序列。用 Uparse(Version 9.2.64)对所有样品的有效 Tags 聚类,以 97%的相似性将序列采样点 1 Sampling site 1采样点 2Sampling site 2采样点 3Sampling site 3过道Passageway39 m10 m图1 小棚采样图Fig.1 Sampling image of small greenhouse第 3 期方 圆等:凡纳滨对虾小型温棚养殖模式
24、水体微生物群落的研究31聚类为分类操作单元(Operational Taxonomic Unit,OTU),计算每个 OTU 在各个样品中的绝对丰度和相对丰度信息。利用 R 语言工具绘制微生物样本稀释曲线。使用 Mothur 软件根据 Chao1、辛普森(Simpson)和香农指数(Shannon)计算菌群 Al-pha 多样性。使用 R 语言 Vegan 包基于加权和非加权 unifrac 距离的排名进行降维分析(NMDS)评估菌群多样性。物种注释基于 SILVA 数据库的 RDPclassifier 2.2 分析每个 16S rRNA 基因序列的系统进化关系,置信阈值为 80%。采用 LE
25、fse 软件,用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfse)分析,对不同组内的生物标志物进行定量分析。采用软件 PI-CRUSt2(https:/ 预测和比较菌群代谢功能的差异。分析方法详见附录 B。1.4 数据处理采用 SPSS 19.0 软件对数据进行方差分析(ANO-VA)和多重比较(LSD 法),微生物群落结构差异的比较采用 Anosim 检验(Analysis of similarities),P0.05 表示差异性显著。相关结果用 Origin 8.0 和Excel 2016 软件作图表示。2 结果 2.1 水质测定结果对一个完整养殖周期内小棚模式池塘水质进行监测。养殖期间,水温、
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