基于修复肠屏障改善抑郁症小...五味子及玫瑰花作用机理研究_张童.pdf
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1、第4 1卷 第3期 陕西科技大学学报 V o l.4 1N o.3 2 0 2 3年6月 J o u r n a l o fS h a a n x iU n i v e r s i t yo fS c i e n c e&T e c h n o l o g y J u n.2 0 2 3*文章编号:2 0 9 6-3 9 8 X(2 0 2 3)0 3-0 0 6 2-0 9基于修复肠屏障改善抑郁症小鼠炎症水平的五味子及玫瑰花作用机理研究张 童1,任 煜1,李 蕾1,裴 环1,蒙 慧1,吴月滢1,2,袁嘉丽1,2*(1.云南中医药大学 基础医学院,云南 昆明 6 5 0 0 0 0;2.云南中
2、医药大学 云南省中医药学分子生物学重点实验室 云南省中医药调节人体微生态创新团队,云南 昆明 6 5 0 0 0 0)摘 要:研究了五味子及玫瑰花对抑郁模型小鼠行为学和炎症水平的影响,以及其抗抑郁作用和相关机制.在实验中,将3 6只C 5 7 B L/6 J小鼠随机分成对照组(C o n t r o l)、模型组(M o d e l)和五味子及玫瑰花治疗组(S+R),每组1 2只.除对照组外,模型组和五味子及玫瑰花治疗组均采用慢性不可预知性温和刺激(C h r o n i cu n p r e d i c t a b l es t r e s s,C UM S)联合孤养制备抑郁模型,连续给予7
3、周刺激,在造模第5周结束后进行行为学检测以判断是否造模成功.在第6周开始,五味子及玫瑰花治疗组给予五味子及玫瑰花灌胃治疗,对照组和模型组给予等量生理盐水.药物干预2周后取材,通过行为学判断小鼠抑郁样行为;E l i s a检测小鼠海马5-羟色胺(5-h y d r o x y t r y p t a m i n e,5-HT)和脑源性神经营养因子(B r a i n-d e r i v e dn e u r o t r o p h i c f a c t o r,B D N F)及血清中白细胞介素-6(I n t e r l e u k i n-6,I L-6)、白细胞介素-1(I n t e
4、 r l e u k i n-1,I L-1)、肿瘤坏死因子-(T u m o rN e c r o s i sF a c t o r-,T N F-)和内毒素(L i p o p o l y s a c c h a r i d e,L P S)的水平;Q-P C R检测结肠组织中I L-6、I L-1、T N F-和L P S的mR NA相对表达量;HE染色观察结肠组织炎症浸润情况;W e s t e r nb l o t检测结肠组织O c c l u d i n、c l a u d i n 1、Z O-1的蛋白表达水平.结果显示,与模型组相比,五味子及玫瑰花治疗组的体重无明显变化(p0.0
5、 5);糖水偏好实验治疗组小鼠糖水偏好率显著上升(p0.0 5),穿越格子数显著上升(p0.0 5);强迫游泳中漂浮时间显著缩短(p0.0 1);海马中的5-HT、B D N F的含量显著上升(p0.0 1);结肠组织炎症浸润程度减轻,同时结肠黏膜屏障相关蛋白O c c l u-d i n、c l a u d i n 1、Z O-1表达显著上升(p0.0 5),结肠组织中I L-6、I L-1、T N F-和L P S的mR-NA相对表达量显著下降(p0.0 5);血清中的I L-6、I L-1、T N F-和L P S水平显著下降(p0.0 5);T h es u g a rp r e f
6、e r e n c er a t eo fm i c e i nt h e t r e a t m e n tg r o u p i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 5),a n dt h en u m b e ro fc r o s s i n gg r i d si n-c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 5);T h ef l o a t i n gt i m ew a ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e n e d(p0.0 1);T
7、h e c o n t e n t so f 5-HTa n dB D N F i nh i p p o c a m p u s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 1);T h ed e-g r e eo f i n f l a mm a t i o n i n f i l t r a t i o n i nc o l o nt i s s u ed e c r e a s e d,a n dt h ee x p r e s s i o no f c o l o nm u c o-s a lb a r r i e rr e l a
8、t e dp r o t e i n sO c c l u d i n,c l a u d i n 1,Z O-1i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 5);T h er e l a t i v ee x p r e s s i o no fmR NAo fI L-6,I L-1,T N F-a n dL P Sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 5);T h e l e v e l s o f I L-6,I L-1,T N F-a n dL P S i ns e r u m
9、d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(p0.0 5);R e s e a r c hs h o w s t h a tS c h i s a n d r ac h i n e n s i sa n dR o s ec a ni m p r o v et h ed e p r e s s i v eb e h a v i o ro fd e p r e s s i o nm o d e lm i c e,a n d i t sm e c h a n i s mm a yb e r e l a t e d t or e p a i r i n g i
10、 n t e s t i n a lm u c o s a l b a r-r i e ra n dr e d u c i n gt h er e l e a s eo f i n t e s t i n a l i n f l a mm a t o r ym e d i a t o r s.K e yw o r d s:s c h i s a n d r ac h i n e n s i s;r o s e;i n t e s t i n a lb a r r i e r;i n f l a mm a t i o n;d e p r e s s i o n0 引言抑郁症是常见的一种全球精神健
11、康相关类的疾病,影响着全世界近3亿人,主要表现为情绪低落、失眠、对外界事物及活动失去兴趣等特征,严重患者甚至会自杀,我国抑郁症发病率逐年上升且发病率呈年轻化趋势1,2.持续性低度免疫炎症反应是重度抑郁症患者的病理特征之一3.多项研究表明,肠道屏障功能损伤与炎症反应息息相关.肠道屏障主要有机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障四部分构成4,可以有效的防止肠内有害物质进入其它的组织和器官.但当肠道屏障完整性遭到破坏,肠屏障通透性增加,肠内细菌移位,内毒素增加,导致肠内炎症,进而诱发的全身炎症反应可能是引起抑郁症的原因之一5,6.目前临床治疗以五羟色胺再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药和四环类抗抑郁药为
12、主,但具有起效慢、服用周期长、副作用大等局限性7.基于此,从中医药多靶点、多途径等特点入手,寻求更为有效且安全的治疗方法有极大的可行性.玫瑰花,味甘微苦,温,归肝、脾二经,具有行气解郁,和血散瘀之效8.现代药理研究表明,玫瑰花的主要活性成分有黄酮类、挥发油和芳香类、多糖类、多酚类、脂肪酸类及其他营养成分,具有抗抑36陕西科技大学学报第4 1卷郁、抗氧化、抑菌等作用9.研究表明,玫瑰花颗粒可显著增加血清中的5-HT含量.改善C UM S小鼠的抑郁样行为1 0.五味子,味酸、甘,性温,归肺、心、肾经,具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心8.药理研究表明五味子主要活性成分为木脂素、挥发油、多糖等,具有镇
13、静催眠、抗抑郁、调节免疫、抑菌等作用1 1.研究发现五味子提取物和五味子木脂素均可减轻L P S诱导模型小鼠中枢和外周的炎症,同时显著改善了模型小鼠的抑郁样行为1 2.玫瑰花行气解郁,五味子补肾宁心,二药合用,增强其抗抑郁、抗炎的作用.目前,动物实验中多选择盐酸氟西汀作为阳性对照药物,盐酸氟西汀为5-HT再摄取抑制剂,通过结合5-HT受体来达到治疗抑郁症的作用,其作用部位为脑内.但本实验意在探讨药物通过修复肠黏膜屏障减轻炎症水平来缓解抑郁症,主要强调了肠道在抑郁症方面的作用靶点,因此未选择阳性药物作为对照.基于此,本实验探究了五味子及玫瑰花能否通过修复肠黏膜屏障减轻炎症从而改善小鼠抑郁样行为,
14、为以后开发抗抑郁相关的保健品以及临床用药提供依据.1 材料与方法1.1 实验动物C 5 7 B L/6雄性小鼠3 6只,体重1 82 0g,46周龄,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证编号:S Y X K(滇)K 2 0 1 3-0 0 0 7.小鼠饲养于云南中医药大学动物房,环境符合动物实验研究相关伦理学要求,独笼饲养,自由进食进水,光照1 2h,平均温度(2 22).所有动物实验均经过云南中医药大学动物伦理实验委员会批准并按照其指导进行,伦理表编号:R-0 6 2 0 2 1 0 8 4.1.2 实验药物、试剂与仪器1.2.1 实验药物及试剂玫瑰花和五味子均购于云南中医药大学校医院,五
15、味 子 批 次:2 0 2 2 0 2 0 1,玫 瑰 花 批 次:F Y-MC 8 2 0;五味子1 0g,玫瑰花8g,水煎剂.小鼠I L-6E L I S A试剂盒(货号:MB-2 8 9 9)、小鼠I L-1E L I S A试 剂 盒(货 号:MB-2 7 7 6)、小 鼠T N F-E L I S A试剂盒(货号:MB-2 8 6 8)、小鼠L P SE L I S A试 剂 盒(货 号:MB-3 4 1 8)、小 鼠5-HTE L I S A试 剂 盒(货 号:MB-3 1 7 9)、小 鼠B D N FE L I S A试剂盒(货号:MB-2 9 4 0),购自江苏酶标生物科技有
16、限公司;A n t i-Z O-1兔抗小鼠一抗(货号:G B 1 1 1 4 0 2)、A n t i-O c c l u d i n兔抗小鼠一抗(货号:G B 1 1 1 4 0 1)、A n t i-c l a u d i n 1兔抗小 鼠一抗(货号:G B 1 1 2 5 4 3),购自武汉赛维尔科技有限公司;山羊抗兔I g G HR P(批号:B L 0 0 3 A),B i o s h a r p公司.1.2.2 实验仪器V i s u T r a c k高端动物行为学分析系统由上海欣软信息科技有限公司提供;大小鼠旷场实验箱上海欣软信息科技有限公司(型号:X R-X Z 3 0 1)
17、;大小鼠强迫游泳实验箱 上海欣软信息科技有限公司(型号:X R-X Q X 2 0 2);小鼠束缚管自制;S y n e r g yH 1型多功能全波段酶标仪,B i oT e k公司;台式高速冷冻离心机(5 4 3 0 R),E p p e n d o r f;组织研磨仪,B u l l e tB l e n d e rS t o r m;Q u a n tS t u d i o实时荧光定量P C R仪,A p p l i e dB i o s y s t e m s公司;B O X-F 3凝胶成像系统,基因有限公司;G E N EGNOME专业化学发光成像系统,X R Q公司.1.3 动物
18、分组按照随机数字表法将3 6只C 5 7 B L/6雄性小鼠分成对照组(C o n t r o l)、模型组(M o d e l)、五味子及玫瑰花治疗组(S+R),每组1 2只.1.4 模型复制与药物干预除对照组外,模型组、五味子及玫瑰花治疗组采用C UM S联合孤养制备抑郁模型:应激源包含禁食(1 2h)、禁水(1 2h)、湿笼(1 2h)、倾笼(1 2h)、夹尾(1m i n)、束缚(1h)、夜间照明(1 2h)、配对居住(1 2h)等,每天随机采用2种应激源,同一应激源不得连续出现,每种应激源每周不超过2次.在造模第5周结束后进行行为学实验以判断是否造模成功,在 造模第6周始给予五 味子
19、及玫瑰 花(0.1 1 7g/m L)进 行 灌 胃 干 预,按 照 小 鼠 体 重(1 0g/m L),对照组和模型组小鼠分别给予0.9%的生理盐水灌胃,按照小鼠体重(1 0g/m L),每天一次,连续灌胃1 4天.1.5 检测指标1.5.1 行为学检测小鼠行为学变化造模期间每周测量小鼠的体重变化,造模结束后进行糖水偏好实验,旷场实验及强迫游泳实验测定小鼠行为学变化.(1)小鼠体重:每周检测小鼠的体重变化.(2)糖 水 偏 好 实 验:在 适 应 阶 段,称 取2瓶5 0m L的1%的糖水置于鼠笼之上,自由饮水2 4h.称取1瓶5 0m L的1%的糖水和5 0m L的饮用水置于鼠笼之上,自由
20、饮水2 4h.开始正式实验,小鼠禁食禁水2 4h,将1瓶5 0m L饮用水水瓶和1瓶5 0m L1%的糖水水瓶分别放于鼠笼,自由饮水46第3期张 童等:基于修复肠屏障改善抑郁症小鼠炎症水平的五味子及玫瑰花作用机理研究3h,3h之后交换饮用水水瓶和糖水水瓶的位置,小鼠自由饮水3h,最后拿下水瓶进行称量其内剩余量.(3)旷 场 实 验:将 小 鼠 放 入 旷 场 箱 内,在V i s u T r a c k高端动物行为学分析系统内划分为33的九宫格,记录小鼠在旷场箱内的总路程,穿梭格子次数.(4)强迫游泳实验:将小鼠放入游泳桶内,强迫游泳6m i n,采用分析系统记录小鼠后4m i n漂浮不动的时
21、间.1.5.2 E l i s a检测小鼠海马内神经递质含量;血清内炎症因子表达水平造模结束后,进行取材,断头去脑,分离海马组织,取血,离心得到小鼠血清.使用试剂盒检测海马5-HT、B D N F水平、检测血清I L-6、I L-1、T N F-和L P S水平,严格按照试剂盒说明书操作.1.5.3 病理切片观察结肠组织炎症浸润程度及黏膜损伤程度造模结束后,取结肠组织,进行HE染色,观察结肠组织炎症浸润程度及黏膜损伤程度.1.5.4 Q-P C R检测结肠组织炎症水平取0.0 50.0 6 g结肠组织研磨后提取R NA,逆转录得到c D NA文库,在冰上配置S Y B RG r e e n预混
22、液在实时P C R系统(A p p l i e dB i o s y s t e m s)上根据说明书进行扩增.引物购于上海生工工程股份公司设计合成,序列见表1所示.表1 L P S、I L-1、T N F-、I L-6引物序列m R NAS e q u e n c e(5 t o3)L P SF o r w a r dp r i m e rC A C A GAA GA G G C AA G G C GA C A GR e v e r s ep r i m e rGAAT GA C C C T GA C T G G C A C T AA C CI L-1F o r w a r dp r i m
23、 e rC A C T A C A G G C T C C GA GA T GAA C AA CR e v e r s ep r i m e rT G T C G T T G C T T G G T T C T C C T T G T A CT N F-F o r w a r dp r i m e rG GA C T A G C C A G GA G G GA GAA C A GR e v e r s ep r i m e rG C C A G T GA G T GAAA G G GA C A GAA CI L-6F o r w a r dp r i m e rC T T C T T G G
24、GA C T GA T G C T G G T GA CR e v e r s ep r i m e rT C T G T T G G GA G T G G T A T C C T C T G T G-a c t i nF o r w a r dp r i m e rT A T C G GA C G C C T G G T T AR e v e r s ep r i m e rT G T G C C G T T GAA C T T G C1.5.5 W e s t e r nb l o t检测结肠黏膜紧密连接蛋白称取0.0 60.0 7 g结肠组织研磨,使用B C A蛋白测定法检测蛋白含量,分
25、别制备1 5%、1 2%、6%的胶,电泳、转膜,封闭1h,加入一抗4过夜,洗膜4次,二抗孵育1h,再次洗膜4次,加E C L发光液拍照,分析图像.1.6 统计方法使用S P S S2 6.0和G r a p h P a d9统计软件进行统计学分析.计量资料以x s表示,计数资料采用秩和检验.采用方差分析比较多组建均数,采用t检验进 行 配 对 样 本 的 分 析.*p0.0 5,*p0.0 5),具体见表2所示.表2 小鼠造模期间体质量变化组别C o n t r o lM o d e lS+Rn1 21 21 2第一周2 2.9 10.8 32 1.6 30.7 52 2.3 80.7 7第二
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