核纤层蛋白B1通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长_王瑞官.pdf
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1、 王瑞官 等/核纤层蛋白 B1 通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1609-1620 DOI:10.13345/j.cjb.220625 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目:解放军总医院第八医学中心课题(2021MS003)This work was supported by the Project of the Eighth Medical Center of Peoples Liberation Army General
2、 Hospital(2021MS003).*Corresponding authors.E-mail:LI Jiangbo,;QIN Lingmei, Received:2022-08-06;Accepted:2022-10-20;Published online:2022-10-24 1609 生物工程学报 核纤层蛋白 B1 通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长 王瑞官1,2,陈思3,孙志佳4,王诗昆5,王杰6,秦玲玫7*,李江波7*1 中国人民解放军总医院 肝胆胰腺外科医学部,北京 100853 2 中国人民解放军总医院 第八医学中心 肝胆外科,北京 100091 3 湖南省职业病防治院 妇
3、产科,湖南 长沙 410021 4 中国人民解放军空军特色医学中心 放疗科,北京 100142 5 新疆军区信息通信旅,西藏 阿里 859499 6 石河子大学医学院,新疆 石河子 832000 7 军事科学院军事医学研究院 生物工程研究所,北京 100089 王瑞官,陈思,孙志佳,王诗昆,王杰,秦玲玫,李江波.核纤层蛋白 B1 通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长J.生物工程学报,2023,39(4):1609-1620.WANG Ruiguan,CHEN Si,SUN Zhijia,WANG Shikun,WANG Jie,QIN Lingmei,LI Jiangbo.Lamin B1 re
4、gulates the growth of hepatocellular carcinoma cells by influencing telomerase activityJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1609-1620.摘 要:核纤层蛋白 B1(nuclear lamina protein B1,LMNB1)高表达于肝癌组织中,通过敲低LMNB1 探讨其对肝癌细胞增殖的影响及其机制。利用 siRNA 在肝癌细胞中敲低 LMNB1,Western blotting 检测敲低效果,使用端粒重复序列扩增法(telomeric repe
5、at amplification protocol assay,TRAP)检测其端粒酶活性变化。利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测其端粒长度变化。并通过 CCK-8、克隆形成、Transwell、划痕实验检测其生长,侵袭和迁移能力变化。利用慢病毒系统构建稳定敲低 LMNB1 的 HepG2 细胞,检测其端粒长度及端粒酶活性变化,采用 SA-gal 衰老染色检测细胞衰老情况,通过裸鼠皮下成瘤实验及对肿瘤后续的组化染色,SA-gal 衰老染色,端粒荧光原位杂交(fluorescence in s
6、itu hybridization,FISH)检测其对成瘤性的影响。最后利用生物信息分析的方法寻找 LMNB1 在临床肝癌组织中的表达情况,及其与临床分期、病人生存期的关系。HepG2 和 Hep3B 中敲低 LMNB1 后端粒酶活性显著降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低,细胞和裸鼠成瘤实验证明稳定敲低 LMNB1 后端粒酶活性降低的同时端粒长度缩短,细胞发生衰老,此外细胞成瘤性降低,Ki-67 表达降低,生物信息分析结果显示,LMNB1 高表达于肝癌组织,且与肿瘤分期和患者生存相关。LMNB1 在肝癌细胞中过表达,其有望成为评估肝癌患者临床预后的指标和精准治疗的靶点。医药生物技术 ISS
7、N 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1610 关键词:核纤层蛋白 B1;肝癌;端粒酶;端粒;细胞衰老 Lamin B1 regulates the growth of hepatocellular carcinoma cells by influencing telomerase activity WANG Ruiguan1,2,CHEN Si3,SUN Zhijia4,WANG Shikun5,WANG Jie6,QIN Lingmei7*,LI Jiangbo7*1 Faculty of Hepato-Pancreat
8、o-Biliary Surgery,Chinese Peoples Liberation Army General Hospital,Beijing 100853,China 2 Department of Hepatobiliary Surgery,the Eighth Medical Center,Chinese Peoples Liberation Army General Hospital,Beijing 100091,China 3 Department of Obstetrics and Gynecology,Hunan Prevention and Treatment Insti
9、tute for Occupational Diseases,Changsha 410021,Hunan,China 4 Radiotherapy Department,Peoples Liberation Army Air Force Characteristic Medical Center,Beijing 100142,China 5 Physician of Information and Communication Brigade of Xinjiang Military Prefecture,Ngari Prefecture 859499,Tibet,China 6 School
10、of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832000,Xinjiang,China 7 Institute of Biotechnology,Academy of Military Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing 100089,China Abstract:Lamin B1(LMNB1)is highly expressed in liver cancer tissues,and its influence and mechanism on the proliferation of
11、 hepatocellular carcinoma cells were explored by knocking down the expression of the protein.In liver cancer cells,siRNAs were used to knock down LMNB1.Knockdown effects were detected by Western blotting.Changes in telomerase activity were detected by telomeric repeat amplification protocol assay(TR
12、AP)experiments.Telomere length changes were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction(qPCR).CCK8,cloning formation,transwell and wound healing were performed to detect changes in its growth,invasion and migration capabilities.The lentiviral system was used to construct HepG2 cells
13、 that steadily knocked down LMNB1.Then the changes of telomere length and telomerase activity were detected,and the cell aging status was detected by SA-gal senescence staining.The effects of tumorigenesis were detected by nude mouse subcutaneous tumorigenesis experiments,subsequent histification st
14、aining of tumors,SA-gal senescence staining,fluorescence in situ hybridization(FISH)for telomere analysis and other experiments.Finally,the method of biogenesis analysis was used to find the expression of LMNB1 in clinical liver cancer tissues,and its relationship with clinical stages and patient su
15、rvival.Knockdown of LMNB1 in HepG2 and Hep3B cells significantly reduced telomerase activity,cell proliferation,migration and invasion abilities.Experiments in cells and tumor formation in nude mice had demonstrated that stable knockdown of LMNB1 reduced telomerase activity,shortened telomere length
16、,senesced cells,reduced cell tumorigenicity and KI-67 expression.Bioinformatics analysis showed that LMNB1 was highly expressed in liver cancer tissues and correlated with tumor stage and patient survival.In conclusion,LMNB1 is overexpressed in 王瑞官 等/核纤层蛋白 B1 通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长 :010-64807509: 1611 li
17、ver cancer cells,and it is expected to become an indicator for evaluating the clinical prognosis of liver cancer patients and a target for precise treatment.Keywords:nuclear lamina protein B1(LMNB1);hepatocellular carcinoma;telomerase;telomere;cell senescence 肝癌是一种起病隐匿、恶性程度高、预后较差的恶性肿瘤,易发生肝内和肝外转移1-2。
18、肝癌按发生部位(肝细胞或肝内胆管上皮细胞)的不同,研究者将其分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝 内 胆 管 癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝细胞-胆管癌(combined hepatocellular cholangiocarcinoma,cHCC-CCA),其中肝细胞癌最为常见3,据最新数据统计,其可占到肝癌的 80%左右。随着人们的生活习惯和工作环境的变化,并且医疗卫生检测水平的提高,肝癌的确诊人数在逐年增加。2020 年全球的肝癌确诊患者超过了 90 万,在我国,原发性肝癌是排在第 4 位的常
19、见恶性肿瘤。由于肝癌多于晚期才被诊断,导致其在肿瘤致死病因中排第 2 位3。肝癌发生发展机制仍不清楚,目前只能通过手术、放化疗和肝移植等手段治疗,但预后仍较差且易复发,有研究表明其 5 年生存率仅为 12.1%4-5。细胞核被认为是真核细胞中最重要的细胞器之一,它包含了整个细胞遗传图谱6。核纤层位于核膜的内层,是由许多蛋白质组成的蛋白质网络,包括核纤层蛋白(lamins),其主要的一个作用是维持细胞的生理平衡7-8。核纤层蛋白有 A 型和 B 型两种类型,A 型核纤层蛋白在力传递过程中占据重要位置9-10,LMNB1、LMNB2、LMNB3 构成 B 型核纤层蛋白,LMNB1基因编码核纤层蛋白
20、 B1(nuclear lamina protein B1,LMNB1)。LMNB1 是一个重要的核骨架组成蛋白11,近年来,对 B 型核纤层蛋白尤其是LMNB1 蛋白的研究越来越受到关注,尤其是在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)中12-13。最新生物信息学方面的研究报道,LMNB1 是肝细胞癌潜在的治疗靶点和预后的生物标志物14,且循环血中 LMNB1 生物标志物可检测早期肝癌15,但具体调控机制仍不清楚。本研究首次揭示了核纤层蛋白 B1 在肝细胞癌的生长、侵袭和转移中的作用及机制。1 材料与方法 1.1 材料 293T 细胞、HepG2 细胞、Hep3B 细胞、s
21、hLMNB1 慢病毒质粒系统由本实验室保存。DMEM 细胞培养基、PBS 缓冲液、FBS、胰酶购于中科迈晨科技有限公司,RIPA 裂解液、12%电泳胶、电泳缓冲液、TBST 缓冲液购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司,端粒探针购自PANAGENE,siRNAs和RNAiMAX购 自Invitrogen公司,Anti-Lamin B1(66095)和-actin(01003)购 自Proteintech公 司。TRAPeze Telomerase Detection kit 购自 Millipore 公司,SA-gal 衰老染色试剂盒购自 Beyotime 公司,CCK-8 试剂盒购自同仁化学公
22、司,DNA 提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。1.2 方法 1.2.1 细胞培养 293T 细胞、HepG2 细胞、Hep3B 细胞用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养于 37 C、5%CO2的细胞培养箱中,根据细胞生长情况和密度进行换液和传代。1.2.2 Western blotting 分析 处理后的细胞加入 RIPA 裂解液进行总蛋白提取,蛋白定量后使用自制 12%电泳胶进 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1612 行 SDS-PAGE,冰浴转膜 2 h,5%脱脂牛奶常温封闭 1 h,一抗 A
23、nti-Lamin B1(1:4 000)、-actin(1:5 000)常温孵育 2 h,TBST 缓冲液洗膜 3 次/5 min,二抗(1:5 000)常温 1 h,TBST缓冲液洗膜 3 次/5 min,使用化学发光显色法显影并保存。1.2.3 RNA 干扰和 shRNA 系统 siRNAmix 冰上解冻,200 L 无血清、无双抗 DMEM 中加入 6 L 20 mol/L siRNAmix、5 L RNAiMax 试剂后混匀,在生物安全柜内室温静置 20 min。均匀加入悬浮的细胞中,做好标记,摇晃混匀,6 h 后换液,72 h 进行后续实验。取病毒包装质粒 PLP1(0.84 g)
24、+PLP2(0.4 g)+VSVG(0.56 g)及目的质粒 1 g,加至200 L 无血清无双抗的培养基中,充分混匀。加入 8.4 L PEI,吹吸混匀,室温静置 20 min。把混合液均匀逐滴加入提前铺好的 293T 细胞中,摇匀;4 h 后换液。48 h 后收集 293T 细胞中形成的病毒液并过滤,随后以 500 L/孔的量加入 6 孔板的 HepG2 细胞中(密度约为 60%)。加病毒液后 48 h 按 1 g/mL 加入嘌呤霉素(puromycin),连续加抗生素 3 d 后,剩下的细胞都是低表达 LMNB1 的稳定克隆细胞。1.2.4 CCK8 和划痕实验 将 LMNB1 敲低后的
25、 HepG2 细胞接种于96 孔板上(3103个细胞/孔板)。CCK8 按照制造商的建议检测细胞增殖。在超净工作台上,用笔在 6 孔板背面画一条水平线,每条水平线与板孔之间的间距为 1 cm。将转染了 siLMNB1 的 HepG2 细胞和阴性对照组铺于 6 孔板上。每个孔加 2 mL 培养基培养 20 h,使其生长成单层细胞。用 10 L的移液器画垂直线、水平线。在每个孔细胞沿孔板壁上缓慢加入 PBS 洗涤 2 次,以清除受损细胞。沿孔壁缓慢加入 2 mL 无血清培养基,避免冲散单层贴壁细胞。将 6 孔板移至培养箱继续培养,分别于 0、6、12 h 用显微镜连续拍照。1.2.5 Transw
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