鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究.pdf
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1、鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究 摘要鸡蛋是人类摄取营养物质的一种重要来源,几乎包含了胚胎发育所需 的所有蛋白质、脂质、维生素、矿物质和生长因子。鸡蛋中的蛋白质主要存在于 蛋清和蛋黄中,其中蛋清蛋白的种类和含量最为丰富。卵白蛋白是蛋清中的主要 蛋白质,占蛋清蛋白质的54%,是获得生物活性肽的很好资源。本文以鸡蛋卵白蛋 白为对象,采用生物酶解、抗氧化试验、离子色谱、反相高效液相色谱、电喷雾 质谱等方法,系统研究了酶水解各主要参数,酶解物抗氧化活性,抗氧化肽的分 离纯化和结构表征,为开发鸡蛋抗氧化肽产品提供理论基础.主要结果如下:1.获得了简便、快速、高纯度的鸡蛋卵白蛋白提取工艺路线。采用Q-Sep
2、h a ros e F户阴离子色谱法对鸡蛋卵白蛋白进行分离.通过对蛋清上样量、缓冲液pH值、缓冲液浓度和洗脱液离子强度等优化试验,获得的工艺条件为:鸡蛋蛋清用2倍 的水稀释,将其pH调至69沉淀去除卵粘蛋白,40mLQ-Seph a ros e FF阴离子柱分 离,蛋清上样量140mL,用0.15mol/LpH8.0的Na CI水溶液洗脱,可获得1058mg 卵白蛋白,卵白蛋白的得率为55%,经反相高效液相色谱检测纯度为92%。2.以羟自由基清除率为指标,研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水 解鸡蛋卵白蛋白所得醉解物的抗氧化活性.研究表明胃蛋白麻的醉解物羟自由基 清除率最高.3.确定了酶解
3、物羟自由基清除率240%的酶解条件,采用响应曲面分析法对 底物浓度S、胃蛋白酶添加量E、酶解时间进行分析,建立了回归模型,确定了 酶解条件,即底物浓度2.22%.3.76%、酶添加量8738.24u/g-I1176.63u/g、水解时 间 4.05-7.77h.4.首次采用多种抗氧化活性试验,全面研究了鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化 活性。体外试验结果表明:酶解物对碱性邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子、Fenton 反应产生的羟基自由基、亚油酸氧化体系中亚油酸的氧化均有明显的抑制作用,且呈现一定的量效关系。5mg/mL的鸡蛋卵白蛋白酶解物,对超氧阴离子的抑制率 为45%,对羟基自由基清除率为56%,
4、对亚油酸辄化的抑制能力相当于0.2mg/mLVE 的抑制能力,均显著高于同浓度的卵白蛋白的抑制能力(p0,05).D-半乳糖复 制衰老小鼠模型的体内抗氧化试验的研究结果表明:高、中剂量的鸡蛋卵白蛋白 酶解物能极显著抑制衰老小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-P x、CAT和TA0C活性的 下降(p0.01);同时能极显著降低衰老小鼠血清和肝脏MDA的水平(p0,05.探讨了不同分子量的鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性.酶解物用三种不 同的超滤膜(MWCO 10,5a nd3k Da)分成四个组分。各个组分显示出不同的抗氧 化活性,其中分子量小于3 k Da的组分最强.6.用离子交换色谱和反相高效液相
5、色谱分离获得了三种鸡蛋卵白蛋白抗氧化 肽.采用Q-Seph a ros cFF离子交换层析法对低分子量酶解物进行分离,分级等度洗 脱,共获得5个组分(OP Ql,OP Q2,OP Q3,OP QOP Q5)。再将抗氧化能力最强的 OP Q3组份用反相高效液相色谱分离纯化,获得了四个肽,其中OP Q3-1、OP Q3-2 和OP Q34具有较强的抗氧化能力,对羟自由基的清除率分别达到78.6%、81.8%和 82.3%.7.采用ES1-MS/MS,对反相高效液相色谱分离纯化获得的3个抗氧化能力较 强的鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的氨基酸序列进行了测定。OP Q3-1的分子量为408.14 Da,由3个旗
6、基酸残基按序列P ro-Gh i-Ty r组成:OP Q3-2的分子量为473.19Da,由4 个矍基酸残基按序列Leu-P ro-As p-Glu组成;OP Q3-4的分子量为433.18Da,由3个氨 基酸残基按序列Trp-Va l-Glu组成。这三个肽分别来源于鸡蛋卵白蛋白第115117、245248和148/50氨基酸残基,均属首次从卵白蛋白中分离获得的抗氧化肽.关键词 鸡蛋卵白蛋白 醐解 抗氧化肽 分离纯化 抗氧化活性ii血n Antioxdation Peptides of Hydrolysates from Hen Egg Ovalbumin Abstrac t:Th e h e
7、n egg is a n importa nt s ou rce of dieta ry nu trients for h u ma n beings,conta ining a ll of th e proteins,lipids,vita mins,minera ls a nd grow th fa ctors req u ired by th e developing embry o.Th e ma jority of proteins exis t in egg y olk a nd egg w h ite,a nd th e s pecies a nd contents of egg
8、 w h ite proteins a re th e mos t a bu nda nt.Ova lbu min is th e ma jor protein,ma k es u p 54%of th e tota l egg proteins,a nd is a s ou rce of bioa ctivity peptides.In th is s tu dy,ou r objective w a s to inves tiga te h y droly s is pa ra meter of ova lbu min,a ntioxida tive a ctivity of h y dr
9、oly s a tes,a nd th e s epa ra tion a nd a na ly s is of a nrioxida tive peptides u s ing enzy me h y droly s is,a ntioxda tive a ctivity a s s a y,ion-exch a ng ch roma togra ph y,RP-HP LC a nd ESI-MS/MS.Ou r res u lts la id a th eoretica l fou nda tion fbr th e development a nd u tiliza tion of eg
10、g a ntioxida tive peptides.1.A s imple ra pid procedu re of prepa ra tion fbr h igh ly pu rified ova lbu min from h eg egg w h ite w a s obta ined.Q-Seph a ros e FF ion-exch a ngc ch roma togra ph y w a s u s ed to s epa ra te a nd pu rify ova lbu min.Th e res u lts s h ow ed th a t ovomu cin cou ld
11、 be precipita ted to remove firom egg w h ite w ith th e condition of egg w h itc/w a ter 1/2(v/v),pH 6.0.Th e s epa ra tion tech nologies of ova lbu min by 40mL Q-Seph a ros e FF colu mn w ere loa ding volu me 140mL of egg w h ite,elu tion w ith Na C1(0.15 mol/L,pH 8.0)a nd 1058mg of ova lbu min w
12、a s extra cted,w ith 55%of recovery ra te a nd 92%of.pu rity ra te.2.Th e a ntioxida tion effects of ova lbu min h y droly s a tes obta ined by peps in,try ps in a nd ch y motry ps in w ere s tu died w ith h y droxy l ra dica l(HO*)s ca venging a ctivity a s th e criterion a nd th e res u lts s h ow
13、 ed th a t th e peps in h y droly s a te pres ented ra th er more s ca venging a ctivity a ga ins t h y droxy l ra dica l(HO*)th a n th e oth er tw o enzy ma tic h y droly s a tes.3.Wh en h y droxy l ra dica l s ca venging a ctivity of h y droly s a tes w a s more th en 40%,th e optimu m tech nologi
14、es of h y droly s is w ere s et u p w ith res pons e s u rfa ce meth odology(RSM)a nd th ey w ere s u bs tra te concentra tion 2.22%3.76%,enzy me concentra tion 8738.24U-11176.63U/g*pro,h y droiy xing time 4.05-7.77 h.4.Mu lti-meth ods of a ntioxida tion tria ls w ere firs tly u s ed to a s s a y th
15、 e a ntioxida tion a ctivity of h en egg ova lbu min h y droly s a tes.Th e tes t res u lts in vitro indica ted th a t h y droly s a tes h a d a dis tinctly inh ibitory a ction to s u peroxide a nion(O;)ma de u-a lk a line py roga llic a cid.HO-produ ced by Fenton rea ction,th e oxida tion of linole
16、ic a cid in linoleic a cid a u toxida tion s y s tem,a nd pres ented a pos itive correla tion.Th e inh ibiton ca pa city of h y droly s a tes a ga ins t Oj a nd HO w ere more th a n 45%a nd 56%repectively a t th e concentra tion more th a n 5 mg/mL.Th e a ntioxida tion tes ts in vivo s h ow ed th a
17、t h igh a nd middle concentra tion of h en egg ova lbu min h y droly s a tes cou ld s ignifica ntly(P 0.01)prevented th e a ctivities of SOD,GSH-P x,CAT a nd T-AOC a ga ins t redu cing a nd a ll th ree concentra tion cou ld s ignifica ntly(P 66磷酯歌乙醉胺(ph os ph a tidy lch oline,P C)24 脑磷脂(ph os ph a t
18、idy leth a nola mine,P E)2.8 溶血卵磷脂(ly s oph os ph a h dy lch oline,LP C)0.6 鞘临磷脂(s ph ingomy elin)0.6胆固醒(ch oles terol)5.0 其他(oth ers)1.0碳水合化物(ca rboh y dniies)0.27.0灰分(a s h)1.12表1-2 蛋白中蛋白质的种类及性质Ta ble!-2 Biologica l Aclivilies oEgg Wh ite P roteins成分含最%P I分子量生物学性质45000免疫调节,降血压,血管卵白蛋白(ova lbu min)5
19、4 694.5 4.8紧张素抑制功能卵铁传递蛋白(ovotra ns femn)95.8 6.080000抗菌、抗病毒、真由.免 疫调节卵类粘蛋白(ovomu coid)113.9 4.328000丝氨酸蛋白葩抑制剂,免 疫谢节卵粘蛋白(ovomu cin)2-2.94.55.15.5 8.3*1()6抗病毒的血凝集作用卵抑制物 Ovoinh ibitor0.1 1.55.1 5.249000抑制蛋白酶,包括胰蛋白 酶和糜蛋白酪无花果蛋白的抑抑制剂0.055.11270014300-17000抑制蛋白陶,包括木瓜蛋 白陶和无花果蛋白酹 抗的、抗微生物、病毒功溶南海(ly s ozy me)3.
20、4 3.510.5-11能,消炎,免疫调节和免 疫增强,抗癌Globu lins G?4.05.536000Globu lins Gj4.05.845000抗生物素蛋白(a vidin)卯巨球蛋白(ovoma croglobu lin)0.059.5 10.068300结合生物素丝氨酸、半胱氨酸蛋白解0.054.5 4.7900000抑制剂,抗菌,促进伤口 愈合卵糖蛋白0.5 1.03.924400黄素蛋白0.83.9 4.132000 36000结合核黄素1.L2.1卵白蛋白卵白蛋白占蛋清中蛋白质的一半以上,是一种磷酸糖蛋白【叫为电泳性质稍有 不同的三组分Ai、A2和Aj的混合物。Ai含两个
21、磷酸基,A?含一个磷酸基,A3不 含磷酸基,它们之间的比例为85:12:3不支 卵白蛋白是由385个氨基酸组成的 单一肽链,每一个分子有一根糖链,卜端和C-端的氨基酸分别为乙酰甘氨酸和脯 甄酸,有1个双硫键和4个疏基,分子量为45k Da,等电点pH为4.5。在贮藏期 间,卵白蛋白转变成S-卵白蛋白,它是一种耐热蛋白质。从功能上讲,卵白蛋白 具有胶凝作用、起泡作用和乳化特性叫但是卵白蛋白在鸡蛋中的生物学地位至今 不清楚,有学者建议,卵白蛋臼可以作为胚胎发育中氨基酸的一种来源.卵白蛋白具有某些免疫调节的特性,在一定剂量和被修饰的条件下被发 减少肿瘤坏死因子TNF a的释放函。LL2.2溶菌前蛋清
22、中含有丰富的溶菌酶,每个鸡蛋中大约含有0.30.4g。鸡蛋清溶菌施是 等电点为P H10.51L0的碱性蛋白质,在蛋清中也部分地与卵粘蛋白、卵铁传递蛋 白及卵白蛋白结合而存在。蛋清溶菌酶的一级结构是包含有129个氨基酸的多肽 链,分子量为14.4k Da.其中有四对半胱氨酸分别为Cy s-6和Cy s-127、Cy s-30和 Cy s-115、Cy s-64和Cy s80及Cy s76和Cy s-94之间形成共价的横桥。溶菌酶分子构象 中存在着螺旋和折迭。溶菌酶(EC 3.2.I.17)是一种N-乙酰胞壁粘肽水解酶,它可以水解细菌细胞壁 肽聚糖中N乙酰胞壁酸和N-葡萄糖胺之间的B(l-4)糖
23、音键UI抑制G.菌。溶菌萌 在与其他物质如尼辛(Nis in)和EDTA结合的前提下具有抗其他腐败微生物和病源 微生物的特性c叫对溶菌悔化学结构的修饰可以增强其抑制G.菌的活性,Ibra h im 通过晶酰化在溶菌酗分子上添加疏水性基团株耦酸或者在溶菌醐段基端插入一疏 水性多肽增强了溶菌防抗埃希氏杆菌的活性“3。Na k a mu ra在溶菌醐分子中连接 半乳甘露聚精的溶菌酶多糖复合也能增强抗G一菌的活性出2叫目前,溶菌酶已作为食品天然防腐剂在食品加工及贮藏中广泛应用物。另 外,溶菌酶还用于口腔保健与治疗,如添加至牙膏、洗口药和口香糖来预防口腔 细菌引起的牙周炎和预防粘膜感染因川。溶菌酶在某些
24、领域还表现有抗病毒特性,在口腔生物表皮的应用发现其具有预防和控制病毒性皮肤感染的功能,如单纯性 疱疹和鸡疳等因L Lee-Hu a ng的研究表明鸡蛋溶菌酣也有抗HAV(人类免疫缺陷 病毒)型的特性口叫溶菌前还可以作为免疫调节和免疫刺激因子,增强免疫球蛋 白活性,对免疫低下的病人进行调节和恢复免疫应答;作为一种抗癌因子,在有 些实验中能抑制肿瘤的生长,并对肿槽的治疔起到辅助增强的作用.1.123卵铁传递蛋白卵铁传递蛋白家族是一种铁结合蛋白,广泛分布在生物的体液中,具有可逆 性结合铁离子的能力12”鸡蛋中的卵铁传递蛋白是近似于血清传递蛋白的蛋白质,每个分子的2个配位中心可与铁、铜或锌等金属圈子结
25、合,由686个氨基酸残基 构成,分子量为7078k Da,等电点pH为6.7。卵铁传递蛋白的功能是防止铁被微生物利用.并作为铁的运输工具RI。卵铁 传递蛋白具有广谱抗菌作用,包括假单胞杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色前萄 球菌、肠沙门氏杆菌等因7叫它通过进入细菌的内膜引起离子的选择性渗透和逸 散作用进行抗菌田】。1.1.2.4抗生物素蛋白抗生物素蛋白是具有结合水溶性维生素能力的蛋白质,是一四聚体糖蛋白 4它不含a-螺旋,由128个氨基酸残基组成,分子量为68.3k Da,等电点pH为9.5 lO.Oo它能抑制生物素细菌和酵母菌的生长卬3%抗生物素蛋白已经被用于癌症的 治疗中,对癌细胞的定位和映像
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- 鸡蛋 卵白 蛋白酶 解物抗 氧化 研究
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