高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 165高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响林 玲,朱浩哲,蒋翊宸,郑燕燕,刘 政,吴中元,丁世杰*,周光宏*(南京农业大学食品科学技术学院,肉品加工与质量控制教育部重点实验室,江苏 南京 210095)摘 要:以猪肌肉干细胞为研究对象,通过接种4 组不同初始密度(2.7103、5.4103、1.1104 cells/cm2和2.2104 cells/cm2)细胞培养3 d,探究高密度条件对猪肌肉干细胞命运的影响,其中2.7103 cells/cm2组为对照组。计数结果表明,猪肌肉干细胞适宜的培养密度为21043104 cells/cm2,超
2、出此范围造成了增殖相关蛋白p-ERK1/2的下调,从而产生增殖抑制效应;转录组测序结果显示最高密度组与对照组相比共有2 125 个差异表达基因,主要富集在细胞衰老、细胞周期和PI3K-Akt等信号通路;深入研究转录组学结果发现,高密度条件下干性基因PAX7、PAX3和静息相关基因SPRY1表达上调;分化基因MYOD、MYOG、MYH3和衰老基因P21、P53、P15出现上调表达。实时聚合酶链式反应和Western Blot结果显示,随着接种密度升高,干性基因PAX7和SPRY1、分化基因MYOG、衰老基因P21均出现上调表达。以上结果表明,猪肌肉干细胞在高密度条件下,会出现重返静息状态、分化和
3、衰老等多种细胞命运。本研究结果有助于理解高密度下细胞命运决定机制,为细胞培养肉研究在高密度条件下调节细胞增殖分化提供一定的理论基础。关键词:肌肉干细胞;高密度培养;衰老;增殖;干性;转录组测序Effect of High-density Culture on the Fate of Porcine Muscle Stem Cells LIN Ling,ZHU Haozhe,JIANG Yichen,ZHENG Yanyan,LIU Zheng,WU Zhongyuan,DING Shijie*,ZHOU Guanghong*(Key Laboratory of Meat Processing
4、and Quality Control,Ministry of Education,College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)Abstract:In this study,four different initial densities(2.7 103 as a control,5.4 103,1.1 104,and 2.2 104 cells/cm2)of porcine muscle stem cells were cultured for thre
5、e days to explore the effect of high-density culture conditions on the fate of porcine muscle stem cells.The counting results showed that the suitable culture density of porcine muscle stem cells was 2 1043 104 cells/cm2,and the proliferation-related protein phosphorylated extracellular signal-regul
6、ated kinase 1/2(p-ERK1/2)was down-regulated when the initial cell density was outside this range,causing a proliferation inhibitory effect.The transcriptome sequencing results showed that 2 125 differentially expressed genes were identified between the highest density and control groups,mainly enric
7、hed in some signaling pathways such as those related to cell senescence and cell cycle and the PI3K-Akt signaling pathway.Furthermore,the expression of the stemness genes PAX7 and PAX3 and the quiescence-related gene SPRY1 was upregulated under high-density conditions.The expression of the different
8、iation genes MYOD,MYOG and MYH3 and the senescence genes P21,P53 and P15 was upregulated.The results of real-time PCR and Western blot assay showed that the expression of PAX7,SPRY1,MYOG,and P21 were upregulated as the cell density increased.The above results showed that porcine muscle stem cells ha
9、d multiple fats such as returning to a quiescent state,differentiation and senescence under high-density conditions.The results of this study can help in understanding the mechanism of cell fate determination and provide a theoretical basis for studying the regulation of cell proliferation and diffe
10、rentiation under high-density condition.Keywords:muscle stem cell;high-density culture;senescence;proliferation;stemness;RNA sequencingDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220928-315中图分类号:TS251.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0165-10收稿日期:2022-09-28基金项目:江苏省青年科学家自然科学基金项目(BK20200537);江苏省重点研发计划(现代农业)项目(BE202030
11、2);“十四五”国家重点研发计划重点专项(2021YFC2101400);国家自然科学基金青年科学基金项目(32101991)第一作者简介:林玲(1995)(ORCID:0000-0001-5390-9152),女,硕士研究生,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:Fiona_*通信作者简介:丁世杰(1990)(ORCID:0000-0002-5807-0103),男,副教授,博士,研究方向为细胞培养肉技术研发和产业化生产。E-mail:周光宏(1960)(ORCID:0000-0002-8960-2141),男,教授,博士,研究方向为畜产品加工。E-mail: 166 2023,Vol
12、.44,No.18 食品科学 生物工程引文格式:林玲,朱浩哲,蒋翊宸,等.高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响J.食品科学,2023,44(18):165-174.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220928-315.http:/LIN Ling,ZHU Haozhe,JIANG Yichen,et al.Effect of high-density culture on the fate of porcine muscle stem cellsJ.Food Science,2023,44(18):165-174.(in Chinese with English abst
13、ract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220928-315.http:/细胞培养肉是指用畜禽干细胞通过体外培养生产出的肉类,是一种新兴肉类生产技术,其优势是低碳环保,未来可作为传统肉类的替代蛋白供应。2013年,荷兰科学家Mark Post教授研制出世界上第一块细胞培养牛肉。2019年11月18日,周光宏教授团队利用幼猪身上分离出来的肌肉干细胞,历时20 d创制了中国第一块细胞培养肉1。近年来,细胞培养肉的基础研究和产业化快速发展,但仍然有许多难题需要解决,其中包括如何获得大量优质的种子细胞用于后续培养肉的三维分化2。肌肉干细胞是培养肉重要的种子细胞之一。肌肉干细胞
14、是肌肉组织里的专能干细胞,当肌肉组织出现损伤时,肌肉干细胞可有效修复和再生肌纤维3。肌肉干细胞通常位于肌膜和基底膜之间,环绕于每根肌纤维周围,因此又被称为肌卫星细胞4。肌肉干细胞在正常成熟的肌肉中表现为静止状态,也是肌纤维生长过程中新肌核的主要来源5-9。肌肉干细胞的数目取决于动物的年龄、种类、骨骼肌类型。例如新生鼠肌肉干细胞数目约占肌细胞核总数的30%,成年后降到约4%,老年则下降到约2%(2930 个月)10。又比如5 d的新生儿和5 个月婴儿的肌肉干细胞分别大约可分裂60 次和46 次,9 岁或者60 岁的人只能够分裂2030 次11。无论在正常情况还是病理情况下,肌肉干细胞都要以自我更
15、新的方式维持肌肉干细胞池12。在肌肉干细胞的大规模培养过程中,由于细胞的贴壁生长特性,不管在2D培养皿还是3D微载体上,极易出现密度较高的情况。已有研究发现,体外培养7 d的牛肌肉干细胞增殖效率下降,且细胞也出现了一些融合的细胞肌管13-14,增殖减缓和自发分化不利于培养后收获高品质的种子细胞。也有研究发现,胚胎干细胞在体外诱导分化为肌肉干细胞过程中,需要其在高密度条件下促进肌源性发育形成肌管15,表明高密度对细胞的分化起到非常重要的作用。在高密度功能维持研究方面,Liu Zheng等16发现激活Hippo通路中的YAP蛋白可提高猪肌肉干细胞的增殖和干性维持能力。目前已有的猪肌肉干细胞高密度培
16、养研究主要针对特定的信号通路和细胞命运,但仍缺少猪肌肉干细胞在高密度培养条件下细胞命运的系统性研究。近年来高通量转录组测序得到快速发展,转录组代表了细胞等样本整体的基因表达水平,能够全局反映细胞的命运变化,目前在包括猪等畜禽动物上也得到大量应用17-19,因此本研究通过对猪肌肉干细胞转录组分析及验证并系统性地探究高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响,旨在为细胞培养肉研究在高密度条件下调节细胞增殖分化提供一定参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂1 周龄公猪(以下简称幼猪),提供自江苏某肉类屠宰加工工厂。澳洲胎牛血清、Hams F-10营养培养基、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibro
17、blast growth factor,bFGF)美国GIBCO公司;I型鼠尾胶原 美国Corning公司;100青链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶溶液 上海贝博生物公司;Trizol总RNA提取试剂及培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;RIPA裂解液(强)上海碧云天生物技术有限公司;TB Green Premix Ex Taq II、PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)日本TaKaRa公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay,BCA)蛋白质定量试剂盒 美国Thermo公司;兔抗P44/4
18、2单克隆抗体、兔抗p-P44/42单克隆抗体 美国CST公司;鼠抗PAX7 美国DSHB研究院;鼠抗MYOG 美国BD公司。1.2 仪器与设备Centrifuge 5702 R低速冷冻离心机、Mastercycler nexus GSX1梯度聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 德国Eppendorf公司;倒置荧光显微镜 德国Leica公司;二氧化碳恒温培养箱 美国Thermo公司;细胞计数仪Countess II 英潍捷基(上海)贸易有限公司;NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度仪 美国Thermo公司;酶标仪 美国Molecular D
19、evices公司;QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 德国Applied Biosystems公司;ImageQuant 4000分子成像仪 美国GE公司;eBlot L1快速湿转仪 金斯瑞生物科技股份有限公司。1.3 方法1.3.1 不同密度猪肌肉干细胞的培养幼猪肌肉干细胞的分离纯化与传代培养参照Liu Zheng等16方法;取第5代肌肉干细胞分别以2.7103、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 1675.4103、1.1104、2.2104 cells/cm2的密度接种于胶原包被的直径10 cm培养皿中,生长培养基(在基础培养基中添加5 ng/
20、mL bFGF)添加量为810 mL,十字摇匀,在37 的CO2培养箱中孵育,第2天换液,第3天观察、拍照、收样进行分析。1.3.2 转录组测序将两组肌肉干细胞(对照组:以2.7103 cells/cm2密度接种培养3 d,编号L-D3;实验组:以2.2104 cells/cm2 密度接种培养3 d,编号H-D3)各取3 个重复,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗,培养皿中加入1 mL Trizol,常温裂解5 min,收集裂解液至1.5 mL离心管,进行转录组测序。1.3.3 总RNA的提取收样:将基础培养基吸掉后用PBS清洗一遍,加入1 mL
21、Trizol裂解5 min并收集至1.5 mL离心管中。RNA提取:向细胞Trizol裂解液中加入200 L氯仿溶液,涡旋振荡15 s后静置2 min,12 000 r/min离心15 min,吸取380 L上清液至RNase-free离心管中,加入同等体积70%乙醇溶液,混匀后加入CR3吸附柱,静置2 min,12 000 r/min离心1 min;加入350 L去蛋白液RW1,静置1 min,12 000 r/min离心1 min;加入80 L DNaseI,静置15 min;再加入350 L去蛋白液RW1,静置1 min,12 000 r/min离心1 min;加入500 L漂洗液RW,
22、静置2 min,12 000 r/min离心1 min;再次加入500 L漂洗液RW,静置2 min,12 000 r/min离心1 min,离心3 min,静置3 min;加入30 L RNase-free水,12 000 r/min离心2 min到新离心管中,即RNA水溶液。总RNA浓度以及纯度的测定:利用超微量分光光度计进行测定,若OD260 nm/OD280 nm值大于1.8,则提取的RNA纯度较好。1.3.4 反转录合成cDNA使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录,按照试剂盒说明书操作,根据测得RNA浓度计算10 L反应体系所用总RNA体积,按表1组分配制反转录反应液(反应液配制在
23、冰上进行);用旋涡振荡器将混合液混合均匀并离心至管底,反转录程序设置为37 反应15 min,85 反应5 s,后降温至4,取出后可20 保存待用。表 1 总RNA的反转录反应体系(10 L)Table 1 Reverse transcription system of RNA(10 L)试剂5PrimeScript RT Master MixTotal RNARNase Free dH2O使用量2 L500 ng根据RNA体积补足至10 L1.3.5 引物设计在NCBI上查找相关基因的mRNA序列,利用Pick Primers设计如表2所示的上下游引物序列。表 2 猪肌肉干细胞实时PCR(r
24、eal-time PCR)所用引物Table 2 Primers used for real-time PCR analysis of porcine muscle stem cells基因上游引物下游引物PAX7GTGCCCTCAGTGAGTTCGATTTCCAGACGGTTCCCTTTGTCSPRY1GCATAGACCTACCAGCCACCTCCGGATTGCCCTTTCAGACP21ACGTCTCAGGAGGACCATGTAGAAGATCAGCCGGCGTTTGMYOGAGGCTACGAGCGGACTGAGCAGGGTGCTCCTCTTCA1.3.6 real-time PCR以cDNA
25、为模板对目标基因和内参基因进行real-time PCR,使用TaKaRa的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行操作,将反转录得到的cDNA模板稀释适当倍数后使用,real-time PCR 20 L反应混合液配制见表3(反应液配制在冰上进行);PCR设置为 95 预变性30 s、95 变性5 s和60 延伸34 s PCR重复40 个循环,95 变性15 s、60 延伸1 min和95 变性15 s溶解曲线分析。其中扩增效率的测定如下:将反转录后的cDNA采用RNase-free水依次进行10梯度稀释,制作5 个浓度梯度(即原始cDNA浓度、101、102、103和1
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