电刺激足三里穴增加mi R-374表达促进自噬缓解肝缺血再灌注损伤机制研究.pdf
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1、中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期电刺激足三里穴增加 miR-374 表达促进自噬缓解肝缺血再灌注损伤机制研究李叶晟1,3,杨宗国2,刘娇1,陆云飞2,陈晹1,张猛1,陈晓蓉2,黄杨卿1摘要目的:探索电刺激足三里穴对肝缺血再灌注损伤的保护作用机制和原理。方法:将 32 只 SD 大鼠随机分为 4 组,假手术组(NT)、缺血再灌注组(IR)、足三里穴电刺激组(IR+EA)、电刺激加 miR-374 阻断组(IR+EA+SiRNA),于再灌注 8 h 取材,每组 8 只。检测血清谷丙转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子(TNF)-琢 浓度,采用实时荧光定量 PCR 技术
2、检测 miR-374 的水平。Western blot 检测 LC-3II、Beclin-1 的蛋白水平。HE 染色检测各实验组肝脏组织损伤情况。比较各组的上述因子水平。结果:与 NT 组相比,缺血再灌注组血清 ALT、TNF-琢 增加(0.001),并随着 miR-374 表达的降低,LC-3II、Beclin-1 表达的增加(0.01),肝细胞损伤严重。与 IR 组相比,IR+EA 组的 ALT、TNF-琢 下降(0.01),同时 miR-374 上调,LC-3II、Beclin-1 进一步增加(0.01),HE 染色发现肝损伤得到缓解。相较于 IR+EA,IR+EA+SiRNA 组逆转了
3、电刺激的治疗作用(0.05)。结论:电刺激足三里穴能增加 miR-374 的表达,从而促进自噬,以减轻缺血再灌注诱导的肝脏损伤。关键词:肝脏缺血再灌注;电刺激穴位;miR-374;自噬中图分类号:R245.9;R26文献标识码:ADOI:10.3969/j.issn.1007-6948.2023.05.020Study on the mechanism of electrostimulation at Zusanli Point to increase miR-374 expression,promoteautophagy and relieve hepatic ischemia reperf
4、usion injuryLI Ye-sheng,YANG Zong-guo,LIU Jiao,et al.Abstract:ObjectiveTo explore the protective mechanism and principle of Electro-Acupuncture atZusanli(ST36)on liver ischemia-reperfusion injury.MethodsThirty-two rats were randomly divided into 4groups:sham-operated group(NT),ischemia-reperfusion g
5、roup(IR),electro-Acupuncture group(IR+EA),electro-acupuncture group+miR-374 inhibitor group(IR+EA+siRNA),electro-acupuncture group+miR-374inhibitor group(IR+EA+siRNA).Samples were collected at 8 hours and each group has 8 rats.Firstly,the serumALT level had been tested.The quantitative PCR was used
6、to detected the expression level of miR-374.TheWestern blot was used to evaluate LC-3II and Beclin-1 protein level.The HE staining was used to measure theliver damage.The one-way ANOVA was used for comparison among multiple groups.ResultsCompared withsham-operated group,ischemia-reperfusion group ha
7、d higher level of liver damage,serum ALT,TNF-琢 withlower expression of miR-374 and higher expression of LC-3II and Beclin-1.Compared with ischemia-reperfusion group,electro-acupuncture group had apparently decreased the liver damage,ALT,TNF-琢 withupregulated miR-374 and higher expression of LC-3II a
8、nd Beclin-1.Compared with electro-acupuncture group,electro-acupuncture group+miR-374 inhibitor groupreversedthetherapeuticaleffectofelectro-acupuncture.ConclusionElectro-acupuncture atZusanli(ST36)upregulated the expression of miR-374,then promoted autophagy to mitigate the liverinjury induced by i
9、schemia-reperfusion.Keywords:Liverischemia-reperfusion;electro-acupuncture;miR-374;autophagy基金项目:2020 年上海市公共卫生临床中心院级科研课题(KY-GW-2020-06)1.上海市公共卫生临床中心肝胆外科(上海 201508)2.上海市公共卫生临床中心中医科(上海 201508)3.复旦大学附属肿瘤医院肝脏外科(上海 200032)通信作者:黄杨卿,E-mail:seric_实验研究672中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期肝脏缺血再灌注损伤是肝肿瘤切除、肝移植和
10、外伤等多种外科手术过程中不可避免的病理结果,是导致肝胆外科术后急性肝坏死的主要高危因素,死亡率几乎高达 100%。肝缺血再灌注是指中断肝血流和氧气供应一段时间,然后重新恢复血液供应的过程,主要以其导致的肝细胞死亡和组织损伤为特征1-3。针灸在我国经过长期的临床实践验证,临床上常用的穴位刺激方法是利用电针对神经、免疫、内分泌等多个系统、器官产生保护作用4-5。本课题组前期研究采用神经传导系统和组织结构上非常接近人体的大鼠,选择对应人体三里穴(ST36)的穴位进行电针刺激,结果发现经电刺激足三里穴可有效减轻肝缺血再灌注损伤大鼠的肝脏组织损伤和炎症反应6。本研究进一步探索了电刺激缓解损伤的分子机制。
11、1材料与方法1.1实验动物及试剂32 只 6耀7 周雄性 SD 大鼠(180耀220 g)购自上海交通大学药学院,饲养于无特定病原体(SPF)清洁级动物房。抗 Beclin-1 抗体(货号 3495)、抗 LC-3II 抗体(货号 12741)和抗 茁-Actin(货号 3700)购自 CST。抗大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-琢 试剂盒(货号 438204)购自 Biolegend。逆转录试剂盒(货号 RR036A)购自 Takara,实时荧光定量 PCR 试剂(货号 QPK-201)来自 TOYOBO。蛋白酶抑制剂购自罗氏。1.2大鼠足三里穴定位大鼠与人体组织结构近,根据大鼠穴位定位图谱选择后
12、三里穴作为靶点穴位,其定位于大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约 5mm 处,左右各一个。1.3构建肝脏缺血再灌注模型将 32 只大鼠随机分为 4 组:假手术组(NT)、缺血组(IR)、足三里穴电刺激组(IR+EA)、电刺激加 miR-374 阻断组(IR+EA+siRNA),每组 8 只。SD 大鼠自由进食 7 d 后禁食过夜,于次日上午固定大鼠进行足三里穴电针刺激:双后肢进针,深度为7mm,给予强度为4mA、2/100Hz电刺激 45 min。尾静脉注射 siRNA(金斯瑞合成,序列CAGTTGACCTGAAGCCGAATTCTAA),100 nmol/只。手术建立 70%肝脏 IR 模型:2.
13、5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹正中切口,分离肝门部结构。3 cm 无损伤血管夹阻断肝左横叶及中叶入肝血流,保留右叶及尾叶血供以确保生命体征稳定。腹腔内滴入无菌0.9%氯化钠溶液 1 mL 补充体液,用 4-0 号线关腹。将大鼠置于恒温室缺血 90 min 后拆线移除血管夹后再次关腹。1.4蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测Beclin-1、LC3 蛋白水平再灌注 8 h 后,取大鼠肝左横叶,分 5 份编号后冻存于-80 益冰箱待检。裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取肝组织蛋白,加入 5伊SDS上样缓冲液混匀,于 100 益煮沸 10 min。配制 12%SDS PAGE 胶,上样后,
14、110 V 电泳分离,250 mA 将蛋白转印至 PVDF 膜,5%脱脂牛奶室温封闭 1.5 h,将 PVDF 膜与抗体 4 益过夜孵育,TBST 洗膜后,室温孵育二抗 1 h,TBST 洗膜后显影。用 Image 分析确定 Beclin-1、LC3 蛋白的相对表达量。1.5逆转录 PCR 和实时荧光定量 PCR 检测 miR-374 水平30 mg 肝组织加入 1 mL Trizol,组织匀浆后,用氯仿和无水乙醇提取 RNA,转录试剂盒获得 cDNA,按照说明书配制荧光定量 PCR 反应体系。使用的引物见表 1。1.6检测血清谷丙转氨酶(ALT)水平所有血清样本各取 50 滋L 放入 0.5
15、 mL 无菌离心管中,送至复旦大学附属上海市公共卫生临床中心实验诊断科,用全自动生化分析仪采用改良赖氏比色法测定样本中的 ALT 的含量。1.7ELISA 法检测血清 TNF-琢 水平在酶标包被板上设标准品孔加,稀释各孔标准品浓度分别至120、80、40、20、10 U/L,设空白孔和待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加稀释液,再加待测样品,用封板膜封板后置于温箱温育。甩干液体,每孔加满洗涤液静置后弃除,重复 5 次。每孔加入酶标试剂,空白孔除外,温箱温育 1 h。洗涤 5 次,依次加入显色剂 A、B,避光显色。加终止液终止反应,于450 nm 波长处测量各孔吸光度值。1.8苏木精-伊红
16、染色(HE)检测肝脏组织形态将切好块的肝组织用 PBS 清洗去除血渍,投入中性福尔马林固定液 30耀50 min。通过梯度酒精(50%、70%、80%、95%、100%)进行脱水,后用二甲苯进行透明处理,浸蜡包埋后,将固定修好的石蜡块放在莱卡切片机载物台上,调整石蜡块与刀口的角度、表 1大鼠定量 PCR 引物序列基因名称引物序列正向5-ATATAATACAACCTGC-3反向5-CACTTAGCTGGTTGTA-3正向5-CCCTGGCTCCTAGCACCAT-3反向5-GATAGAGCCACCAATCCACACA-3miR-374茁-actin673中国中西医结合外科杂志 2023 年 10
17、 月第 29 卷第 5 期位置,调整切片厚度为 6 滋m。将切好的石蜡带放置于载破片上,烘干。通过梯度二甲苯、酒精进行脱蜡,将切片放入苏木精中染色 10 min,用自来水流水冲洗 15 min;再进行梯度酒精脱水,用 0.5%伊红乙醇液染色 13 min,用 95%乙醇洗去多余的红色。最后放入无水乙醇、二甲苯 I、II、III 各 10 min,利用中性树胶封存。20 倍显微镜下观察肝脏组织形态。1.9统计学分析数据结果用 x依s 表示,采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。两组比较采用 检验,0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1电刺激足三里穴可减轻 IR 引起的肝
18、脏损伤相关血生化指标ELISA 结果显示,IR 引起血清 ALT表达明显升高,IR+EA 组 ALT 升高被抑制(图 1A);IR 引起 TNF-琢 释放量增加,给予足三里穴电刺激后 TNF-琢 释放量减少(图 1B)。2.2电刺激足三里穴可上调 IR 大鼠肝脏组织中miR-374PCR 检测显示,与 NT 组相比,IR 组大鼠肝组织 miR-374 明显降低;足三里穴电针刺激组(IR+EA)肝组织 miR-374 上调(图 2)。2.3电刺激足三里穴可增强自噬Western blot结果显示,与 NT 组相比,IR 组 LC-3II、Beclin-1蛋白表达显著升高;足三里穴电针刺激组(IR
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