大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价.pdf
《大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、中国农业科学 2023,56(14):2751-2760 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.010 收稿日期:2022-11-13;接受日期:2022-12-21 基金项目:国家重点研发计划(2021YFD1700200)、云南省重大科技专项计划(202202AE090025)、国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-04)联系方式:马鸣超,E-mail:。通信作者姜昕,E-mail: 开放科学(资源服务)标识码(OSID):大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方法的建立及应用效果评价 马
2、鸣超,姜昕?,王鹏辉,关大伟,李俊 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京 100081 摘要:【目的】大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)是微生物肥料重要的功能菌种之一,可通过生物固氮为大豆生长提供氮素,实现节本增效,菌株 5873 作为其典型代表,已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物,建立大豆根瘤菌5873 菌株水平的快速检测方法,对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌 5873 为供试材料,基于其全基因组序列和 NCBI 数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列,以及与其高度同源(基因组 ANI 值大于
3、 99.95%)的大豆根瘤菌 USDA 6T差异片段,通过多重序列比对,进行特异引物设计和筛选,获得特异性引物对,并通过对 PCR 反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测,建立大豆根瘤菌 5873 的快速检测方法。然后,采用盆栽试验,将大豆根瘤菌 5873 与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际,应用上述方法对大豆根瘤菌 5873 竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物 4-4 和 Q1(4-4-F 5-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3/4-4-R 5-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3和 Q1-F 5-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3/Q
4、1-R 5-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3),优化并建立了 PCR 快速检测方法,即反应体系:Premix TaqTM 12.5 L,引物各 1.0 L,基因组 DNA 15 ng 左右,加 ddH2O 补足至 25 L;反应条件:95 预热 5 min,94 变性 45 s,61 退火 45 s,72 延伸 60 s,30 个循环,再 72 延伸 10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无(355 和 218 bp),即可实现大豆根瘤菌 5873 的快速检测,该方法检出灵敏度为 1 850 CFU/L。此外,借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌 5873 竞争结瘤能力,与传统
5、BOX-PCR 评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌 5873 快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板,直接进行 PCR 扩增的鉴定操作,省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA 提取及测序鉴定等繁琐的环节,大大减少了工作量,只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌 5873,为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。关键词:大豆根瘤菌;特异引物;PCR 扩增;竞争结瘤 Rapid Identification for Bradyrhizobium japonicum 5873 by PCR and Its Evaluation in Applic
6、ation MA MingChao,JIANG Xin?,WANG PengHui,GUAN DaWei,LI Jun Institute of Agricultural Resources and Agricultural Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081 Abstract:【Objective】Bradyrhizobium japonicum is one of the important functional bacteria in microbial fertilizer
7、products.As a commercialized strain,B.japonicum 5873 was wildly used in agricultural production and played important roles in symbiotic nitrogen fixation.Therefore,it is necessary to establish a rapid identification method at the strain level by screening and identifying specific primers for rhizobi
8、a,and is of great importance in the aspects of microbial fertilizer product quality inspection,2752 中 国 农 业 科 学 56 卷 strain identification and function evaluation.【Method】According to the whole genome sequencing of B.japonicum 5873 and other strain related sequences from NCBI,as well as the differen
9、tial fragments of B.japonicum USDA 6T which is highly homologous to B.japonicum 5873(the ANI value of the genome is greater than 99.95%),specific PCR primers were designed and obtained.After optimization of PCR reaction conditions and the detection of sensitivity and specificity,a rapid detection me
10、thod for B.japonicum 5873 was established.Then,using pot experiment,B.japonicum 5873 was mixed with other rhizobium strains and inoculated in the soybean rhizosphere,and the above method was used to evaluate the competitive nodulation ability of B.japonicum 5873.【Result】A set of species-specific pri
11、mers 4-4 and Q1(4-4-F 5-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3/4-4-R 5-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3 and Q1-F 5-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3/Q1-R 5-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3),were successfully designed to selectively amplify 355 and 218 bp amplicon from B.japonicum 5873.Well specificity was demonstrated by reference strains,from w
12、hich only the targeted bands of B.japonicum 5873 were observed.Amplifications were performed in a 25 L reaction mixture,which contained Premix TaqTM 12.5 L,template DNA(15 ng of genomic DNA),primers 4-4 and Q1(1.0 L,respectively).The PCR cycling consisted of one cycle of 5 min at 95 and 30 cycles of
13、 45 s at 94,45 s at 61,and 60 s at 72.A final extension step was run for 10 min at 72.The sensitivity was 1 850 CFU/L.In addition,the method mentioned above was successfully used to evaluate the competitive nodulation ability of B.japonicum 5873,which was consistent with the results of traditional B
14、OX-PCR identification.【Conclusion】The established rapid detection method can directly use the bacterial solution or squeezed nodules as templates,which will eliminate laborious tasks,such as processes of nodule isolation,purification,culture,DNA extraction,sequencing and sequence comparison.It only
15、takes a few hours to accurately detect B.japonicum 5873,which provides a reference for product quality detection and competitive nodulation ability evaluation of microbial fertilizers.Key words:Bradyrhizobium japonicum;strain-specific primer pair;PCR amplification;competitive nodulation 0 引言【研究意义】随着
16、国家在农业战略上的调整,发展资源节约型、环境友好型的“两型农业”成为现代农业可持续发展的必由之路1。其中,包括根瘤菌在内的微生物肥料作为绿色新型投入品和优先发展的生物制品,在减肥减药、节本增效、提高作物品质等方面表现突出2。大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)可与大豆形成高效的共生固氮体系,有效减少化学氮肥的施用3-4,是微生物肥料中重要的功能菌种之一,大豆根瘤菌 5873 作为其典型代表,目前已在农业农村部登记并广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异性引物,建立菌株水平的快速检测方法,对微生物肥料产品质量检测、功能评价及菌株知识产权保护具有重要的研究意义和实践价值。【
17、前人研究进展】目前对于大豆根瘤菌的检测主要依靠传统的形态学分析和 Biolog 等生理生化鉴定5-6,基于 16S rDNA、atpD、dnaK、gyrB、glnII、recA、rpoB 和 ftsA 基因等保守序列的系统发育学分析等传统多相分类鉴定7-13,以及新发展起来的全基因组测序14、平均核苷酸一致性(ANI)比较15、多位点序列分析(MLSA)法16、BOX-PCR 指纹图谱分析17等技术,其结果通常可实现种水平、菌株水平上的鉴别14-19,但由于操作步骤多、时间长,难以广泛地实施推广。以慢生大豆根瘤菌为例,包括在国内外广泛商业化应用的菌株大豆根瘤菌 USDA 110T20(后改为有
18、效慢生根瘤菌21)和国内外研究较为常见模式菌株大豆根瘤菌 USDA 6T15,22-23在内,均未建立菌株水平的快速检测技术。此外,在全基因组水平上,大豆根瘤菌 5873和 USDA 6T的基因组 ANI 值等于 99.95%,前者与后者相比缺失了一段 51 bp 的序列,另外,两个菌株间还有 3 个 SNP 位点差异,常规技术手段很难区分。在应用层面上,土壤中存在大量竞争结瘤能力强而固氮能力弱的土著根瘤菌群,这直接影响到接种根瘤菌剂的占瘤率,导致其接种效果不理想24-25。目前,BOX-PCR 被广泛地应用于根瘤菌占瘤率的测定26-27,但在操作中需要根瘤菌分离纯化培养、DNA 提取及需要结
19、合基因测序鉴定等繁琐环节,费时费力,且试验结果重复性差,实验室间结果很难重现。【本研究切入点】鉴于以上问题,亟需建立菌株快速检测和评价技术。因此,本研究选用自主研发且已商业化的大豆根瘤菌 5873 为供试材料,设计特异性引物,建立 PCR快速检测方法。【拟解决的关键问题】在特异性引物设计上,除考虑大豆根瘤菌 5873 全基因组序列和NCBI 数据库大豆根瘤菌参比菌株相关序列外,重点分析与其高度同源的大豆根瘤菌 USDA 6T差异片段,设计引物,优化 PCR 反应条件/体系,并进行特异性及灵敏度检测,实现大豆根瘤菌菌株水平上的快速检14 期 马鸣超等:大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方
20、法的建立及应用效果评价 2753 测,为微生物肥料中根瘤菌的检测和竞争结瘤能力评价提供技术支撑。1 材料与方法 试验于 20202021 年在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所完成。1.1 供试菌株 选用商业化菌株大豆根瘤菌 5873 为供试菌株,以实验室保藏的 42 株慢生根瘤菌属、2 株中华根瘤菌属和 1 株根瘤菌属的菌株为参比菌株(含模式菌株),结合 NCBI 数据库中大豆根瘤菌相关序列,进行引物设计和特异性验证。供试菌株及编号见表 1。表 1 供试菌株 Table 1 The strains used in this study 种种 Species 菌株编号菌株编号 No.of
21、strain 大豆根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T,5821,5841,5876,5547,5588,5665,5129,4892,5452,5599,5016,5437,4129,4470,4530,4438,5248,4784,5528,5412,5260,4503,5039,4248,5240,5190,5742,4855,4794,4291,4698,5128,4770,4296,4207,4543 有效慢生根瘤菌 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110T,5119 埃氏慢生根瘤菌 Bradyrhizobiu
22、m elkanii 5136,5161,5109 弗氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii USDA 205T,4475 奥氏根瘤菌 Rhizobium alamii 4370 1.2 主要试剂和仪器 TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技北京有限公司);Fast-T1 化学感受态细胞、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit、Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、Fast Pure Plasmid Mini Kit 等均购自南京诺唯赞生物科技公司;裂解液配制28(20 mmolL-1 Tri
23、s(pH 8.0)、25 mmolL-1 NaCl、2.5 mmoLL-1 EDTA、0.05%SDS、5%chelex-100);Premix Taq(TaKaRa公司);YMA 液体培养基(甘露醇 10 g、七水合硫酸镁 0.2 g、氯化钠 0.1 g、磷酸二氢钾 0.5 g、酵母膏0.5 g,定容至 1 L,pH 6.87.2);C1000 PCR 仪、凝胶成像系统(Bio-Rad 公司);DYY-8C 电泳仪(北京市六一仪器厂);NanoDropND-2000C 微量紫外分光光度计(Thermo)。1.3 菌株 DNA 提取与纯度检测 挑取培养好的单菌落,采用 TIANamp Bact
24、eria DNA Kit 提取菌株 DNA,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,并用 NanoDropND-2000C 微量紫外分光光度计检测其浓度。1.4 特异引物设计和筛选 大豆根瘤菌 5873 基因组总长度为 9 160 134 bp(登录号:WWEZ00000000),选取其中 scf-1 序列(总长度为 1 442 588 bp),初步分割成 721 个 2 kb的片段,在 GenBank 数据库进行序列比对,找出同源性较低的特异序列。在 NCBI 数据库中,将特异序列进行 primer-BLAST,综合考虑引物长度、GC 含量、是否产生二聚体及发夹结构等原则,引物设计选择默认值设定
25、为 20 bp,GC 含量选择为 40%60%,两引物之间不存在互补结构,进行特异性引物设计,然后从 16 个同源性较低的 2 kb 的片段中,选择较好的 20对引物进行 PCR 验证。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。分别提取大豆根瘤菌 5873 和上述参比菌株DNA,进行 PCR 扩增,产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,以筛选具有特异性的引物,同时以无菌水为阴性对照。1.5 PCR 扩增优化及方法建立 1.5.1 PCR 体系/反应条件的建立与优化 以大豆根瘤菌 5873 基因组 DNA 为模板,进行 PCR 扩增。通过优化退火温度(5461)、模板 DNA 量(351 ng)、引
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价 大豆 根瘤菌 菌株 5873 PCR 快速 检测 方法 建立 应用 效果 评价
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。