大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价.pdf

中国农业科学 2023,56(14):2751-2760 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.010 收稿日期：2022-11-13；接受日期：2022-12-21 基金项目：国家重点研发计划（2021YFD1700200）、云南省重大科技专项计划（202202AE090025）、国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-04）联系方式：马鸣超，E-mail：。通信作者姜昕，E-mail： 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方法的建立及应用效果评价 马鸣超，姜昕?，王鹏辉，关大伟，李俊 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081 摘要：【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株 5873 作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873 菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌 5873 为供试材料，基于其全基因组序列和 NCBI 数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组 ANI 值大于 99.95%）的大豆根瘤菌 USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对 PCR 反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌 5873 的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌 5873 与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌 5873 竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物 4-4 和 Q1（4-4-F 5-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3/4-4-R 5-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3和 Q1-F 5-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3/Q1-R 5-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3），优化并建立了 PCR 快速检测方法，即反应体系：Premix TaqTM 12.5 L，引物各 1.0 L，基因组 DNA 15 ng 左右，加 ddH2O 补足至 25 L；反应条件：95 预热 5 min，94 变性 45 s，61 退火 45 s，72 延伸 60 s，30 个循环，再 72 延伸 10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355 和 218 bp），即可实现大豆根瘤菌 5873 的快速检测，该方法检出灵敏度为 1 850 CFU/L。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌 5873 竞争结瘤能力，与传统 BOX-PCR 评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌 5873 快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行 PCR 扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA 提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌 5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。关键词：大豆根瘤菌；特异引物；PCR 扩增；竞争结瘤 Rapid Identification for Bradyrhizobium japonicum 5873 by PCR and Its Evaluation in Application MA MingChao,JIANG Xin?,WANG PengHui,GUAN DaWei,LI Jun Institute of Agricultural Resources and Agricultural Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081 Abstract:【Objective】Bradyrhizobium japonicum is one of the important functional bacteria in microbial fertilizer products.As a commercialized strain,B.japonicum 5873 was wildly used in agricultural production and played important roles in symbiotic nitrogen fixation.Therefore,it is necessary to establish a rapid identification method at the strain level by screening and identifying specific primers for rhizobia,and is of great importance in the aspects of microbial fertilizer product quality inspection,2752 中 国 农 业 科 学 56 卷 strain identification and function evaluation.【Method】According to the whole genome sequencing of B.japonicum 5873 and other strain related sequences from NCBI,as well as the differential fragments of B.japonicum USDA 6T which is highly homologous to B.japonicum 5873(the ANI value of the genome is greater than 99.95%),specific PCR primers were designed and obtained.After optimization of PCR reaction conditions and the detection of sensitivity and specificity,a rapid detection method for B.japonicum 5873 was established.Then,using pot experiment,B.japonicum 5873 was mixed with other rhizobium strains and inoculated in the soybean rhizosphere,and the above method was used to evaluate the competitive nodulation ability of B.japonicum 5873.【Result】A set of species-specific primers 4-4 and Q1(4-4-F 5-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3/4-4-R 5-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3 and Q1-F 5-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3/Q1-R 5-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3),were successfully designed to selectively amplify 355 and 218 bp amplicon from B.japonicum 5873.Well specificity was demonstrated by reference strains,from which only the targeted bands of B.japonicum 5873 were observed.Amplifications were performed in a 25 L reaction mixture,which contained Premix TaqTM 12.5 L,template DNA(15 ng of genomic DNA),primers 4-4 and Q1(1.0 L,respectively).The PCR cycling consisted of one cycle of 5 min at 95 and 30 cycles of 45 s at 94,45 s at 61,and 60 s at 72.A final extension step was run for 10 min at 72.The sensitivity was 1 850 CFU/L.In addition,the method mentioned above was successfully used to evaluate the competitive nodulation ability of B.japonicum 5873,which was consistent with the results of traditional BOX-PCR identification.【Conclusion】The established rapid detection method can directly use the bacterial solution or squeezed nodules as templates,which will eliminate laborious tasks,such as processes of nodule isolation,purification,culture,DNA extraction,sequencing and sequence comparison.It only takes a few hours to accurately detect B.japonicum 5873,which provides a reference for product quality detection and competitive nodulation ability evaluation of microbial fertilizers.Key words:Bradyrhizobium japonicum;strain-specific primer pair;PCR amplification;competitive nodulation 0 引言【研究意义】随着国家在农业战略上的调整，发展资源节约型、环境友好型的“两型农业”成为现代农业可持续发展的必由之路1。其中，包括根瘤菌在内的微生物肥料作为绿色新型投入品和优先发展的生物制品，在减肥减药、节本增效、提高作物品质等方面表现突出2。大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）可与大豆形成高效的共生固氮体系，有效减少化学氮肥的施用3-4，是微生物肥料中重要的功能菌种之一，大豆根瘤菌 5873 作为其典型代表，目前已在农业农村部登记并广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异性引物，建立菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料产品质量检测、功能评价及菌株知识产权保护具有重要的研究意义和实践价值。【前人研究进展】目前对于大豆根瘤菌的检测主要依靠传统的形态学分析和 Biolog 等生理生化鉴定5-6，基于 16S rDNA、atpD、dnaK、gyrB、glnII、recA、rpoB 和 ftsA 基因等保守序列的系统发育学分析等传统多相分类鉴定7-13，以及新发展起来的全基因组测序14、平均核苷酸一致性（ANI）比较15、多位点序列分析（MLSA）法16、BOX-PCR 指纹图谱分析17等技术，其结果通常可实现种水平、菌株水平上的鉴别14-19，但由于操作步骤多、时间长，难以广泛地实施推广。以慢生大豆根瘤菌为例，包括在国内外广泛商业化应用的菌株大豆根瘤菌 USDA 110T20（后改为有效慢生根瘤菌21）和国内外研究较为常见模式菌株大豆根瘤菌 USDA 6T15,22-23在内，均未建立菌株水平的快速检测技术。此外，在全基因组水平上，大豆根瘤菌 5873和 USDA 6T的基因组 ANI 值等于 99.95%，前者与后者相比缺失了一段 51 bp 的序列，另外，两个菌株间还有 3 个 SNP 位点差异，常规技术手段很难区分。在应用层面上，土壤中存在大量竞争结瘤能力强而固氮能力弱的土著根瘤菌群，这直接影响到接种根瘤菌剂的占瘤率，导致其接种效果不理想24-25。目前，BOX-PCR 被广泛地应用于根瘤菌占瘤率的测定26-27，但在操作中需要根瘤菌分离纯化培养、DNA 提取及需要结合基因测序鉴定等繁琐环节，费时费力，且试验结果重复性差，实验室间结果很难重现。【本研究切入点】鉴于以上问题，亟需建立菌株快速检测和评价技术。因此，本研究选用自主研发且已商业化的大豆根瘤菌 5873 为供试材料，设计特异性引物，建立 PCR快速检测方法。【拟解决的关键问题】在特异性引物设计上，除考虑大豆根瘤菌 5873 全基因组序列和NCBI 数据库大豆根瘤菌参比菌株相关序列外，重点分析与其高度同源的大豆根瘤菌 USDA 6T差异片段，设计引物，优化 PCR 反应条件/体系，并进行特异性及灵敏度检测，实现大豆根瘤菌菌株水平上的快速检14 期 马鸣超等：大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方法的建立及应用效果评价 2753 测，为微生物肥料中根瘤菌的检测和竞争结瘤能力评价提供技术支撑。1 材料与方法 试验于 20202021 年在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所完成。1.1 供试菌株 选用商业化菌株大豆根瘤菌 5873 为供试菌株，以实验室保藏的 42 株慢生根瘤菌属、2 株中华根瘤菌属和 1 株根瘤菌属的菌株为参比菌株（含模式菌株），结合 NCBI 数据库中大豆根瘤菌相关序列，进行引物设计和特异性验证。供试菌株及编号见表 1。表 1 供试菌株 Table 1 The strains used in this study 种种 Species 菌株编号菌株编号 No.of strain 大豆根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T,5821,5841,5876,5547,5588,5665,5129,4892,5452,5599,5016,5437,4129,4470,4530,4438,5248,4784,5528,5412,5260,4503,5039,4248,5240,5190,5742,4855,4794,4291,4698,5128,4770,4296,4207,4543 有效慢生根瘤菌 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110T,5119 埃氏慢生根瘤菌 Bradyrhizobium elkanii 5136,5161,5109 弗氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii USDA 205T,4475 奥氏根瘤菌 Rhizobium alamii 4370 1.2 主要试剂和仪器 TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技北京有限公司）；Fast-T1 化学感受态细胞、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit、Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、Fast Pure Plasmid Mini Kit 等均购自南京诺唯赞生物科技公司；裂解液配制28（20 mmolL-1 Tris（pH 8.0）、25 mmolL-1 NaCl、2.5 mmoLL-1 EDTA、0.05%SDS、5%chelex-100）；Premix Taq（TaKaRa公司）；YMA 液体培养基（甘露醇 10 g、七水合硫酸镁 0.2 g、氯化钠 0.1 g、磷酸二氢钾 0.5 g、酵母膏0.5 g，定容至 1 L，pH 6.87.2）；C1000 PCR 仪、凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）；DYY-8C 电泳仪（北京市六一仪器厂）；NanoDropND-2000C 微量紫外分光光度计（Thermo）。1.3 菌株 DNA 提取与纯度检测 挑取培养好的单菌落，采用 TIANamp Bacteria DNA Kit 提取菌株 DNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用 NanoDropND-2000C 微量紫外分光光度计检测其浓度。1.4 特异引物设计和筛选 大豆根瘤菌 5873 基因组总长度为 9 160 134 bp（登录号：WWEZ00000000），选取其中 scf-1 序列（总长度为 1 442 588 bp），初步分割成 721 个 2 kb的片段，在 GenBank 数据库进行序列比对，找出同源性较低的特异序列。在 NCBI 数据库中，将特异序列进行 primer-BLAST，综合考虑引物长度、GC 含量、是否产生二聚体及发夹结构等原则，引物设计选择默认值设定为 20 bp，GC 含量选择为 40%60%，两引物之间不存在互补结构，进行特异性引物设计，然后从 16 个同源性较低的 2 kb 的片段中，选择较好的 20对引物进行 PCR 验证。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分别提取大豆根瘤菌 5873 和上述参比菌株DNA，进行 PCR 扩增，产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，以筛选具有特异性的引物，同时以无菌水为阴性对照。1.5 PCR 扩增优化及方法建立 1.5.1 PCR 体系/反应条件的建立与优化 以大豆根瘤菌 5873 基因组 DNA 为模板，进行 PCR 扩增。通过优化退火温度（5461）、模板 DNA 量（351 ng）、引物添加量（浓度为 10 molL-1，0.52.0 L）等建立最适 PCR 反应条件/体系。1.5.2 菌落 PCR 扩增 菌株用 YMA 液体培养基于30，180 r/min 培养 5 d。取 2 L 作为模板，以最优化的 PCR 条件进行菌落 PCR 验证。1.5.3 灵敏度检测 将大豆根瘤菌 5873 接种于YMA 培养基，180 r/min，30，培养 5 d，用无菌水对上述培养液进行系列梯度稀释。分别取 2 L 为模板，进行最优条件的菌落 PCR 反应。并将稀释倍数为105、106和 107的菌液涂布于添加琼脂的 YMA 培养基 2754 中 国 农 业 科 学 56 卷 平板上进行菌落计数。每个稀释梯度做 3 个平行。1.5.4 目的条带验证 以大豆根瘤菌 5873 DNA 为模板，以最优 PCR 反应条件进行 PCR 扩增，PCR 产物经试剂盒纯化后，与 pCE2 载体连接，转化，培养后，随机挑取阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.6 方法验证及评价应用 1.6.1 菌剂制备及盆栽试验 将供试菌株大豆根瘤菌 5873、实验室保存的菌株大豆根瘤菌 5841、5821、5136、5119、5665和商业化菌株有效慢生根瘤菌USDA 110T，分别进行液体发酵培养。然后，将大豆根瘤菌5873分别与其他6株菌两两等体积混合后作为复合菌剂待用。选择大小相近的大豆种子，在 95%的酒精中浸泡1 min，用 5%次氯酸钠灭菌 5 min，然后用无菌水清洗56 次。分别将每株菌的发酵液与保护剂共同包衣在灭菌的大豆种子表面，播种在盛有灭菌蛭石的塑料盆（9.5 cm10 cm）中，作为阳性对照；把两两混合后的复合菌剂与保护剂共同包衣后播种，作为处理组。将植株置于光照培养箱中，光照 10 h、28，黑暗14 h、25。出苗后每盆留苗 3 棵，并以不接种为阴性对照。每个处理设 3 个重复，培养 40 d 后测定大豆根瘤数量及大豆根瘤菌 5873 占瘤率。1.6.2 占瘤率测定 分别用本研究建立的 PCR 快速 检测技术及传统 BOX-PCR 两种方法测定大豆根瘤菌5873 占瘤率。测定时，将大豆根部置于自来水中冲洗干净，把根瘤浸泡于蒸馏水中重复 34 次，然后，将清洗的根瘤蘸取 95%的酒精，用火焰进行灼烧。挑取充分灭菌的根瘤，放置于 1.5 mL 的 EP 管中，加入 200 L 的裂解液，用灭菌的竹签将根瘤破碎。破碎的液体置于振荡仪上充分混合，置于沸水浴中 5 min，在-20 进行冰冻。取 2.0 L 冻融的样品作模板，进行上述特异 PCR 扩增和 BOX-PCR 扩增22，将产物电泳后统计条带，计算大豆根瘤菌 5873 占瘤率。2 结果 2.1 特异引物设计及筛选 2.1.1 基因组序列比对及特异引物设计 通过对大豆根瘤菌 5873 和 USDA 6T的基因组比较发现（图 1），大豆根瘤菌 5873 基因组缺失了 51 bp 序列，经测序和比对，该缺失序列参与编码 YcjX 家族蛋白基因。因此，特异引物设计采用如下策略，即在 NCBI 数据库中进行大豆根瘤菌参比菌株序列比对，找到大豆根瘤菌 5873 的特异序列进行引物设计，保证其与除大豆根瘤菌 USDA 6T之外的菌株有较好的特异性。其次，通过缺失段序列，设计特异性引物，以区分 5873 与USDA 6T。引物设计示意图见图 2，引物部分结果如表 2 所示。图 1 菌株的序列差异比较 Fig.1 Comparison of sequence diversity of the two strains 表 2 大豆根瘤菌 5873 的特异序列引物设计结果 Table 2 Design results of specific sequence primers for B.japonicum 5873 in primer-BLAST 引物引物 Primer 序列序列 Sequence(5-3)长度长度 Length(bp)Tm GC(%)4-4 Forward primer GATAAGGCCACGGGTGAACA 20 60.04 55.00 4-4 Reverse primer CACTCGATAAGCTCCGCTGT 20 59.90 55.00 Q1 Forward primer CCGGTCGTGACTGGAATGAT 20 59.82 55.00 Q1 Reverse primer TCGAGGCCTACAAGAACGTC 20 59.48 55.00 14 期 马鸣超等：大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方法的建立及应用效果评价 2755 图 2 引物设计示意图 Fig.2 Schematic diagram for the design of specific sequence primers 2.1.2 特异引物筛选 以大豆根瘤菌 5873 和上述参比菌株 DNA 为模板，分别将设计的 20 对特异性引物进行 PCR 扩增，供试引物中只有 4-4 与 5873、USDA 6T产生 355 bp 扩增条带（图 3-A、3-B），表明 4-4引物扩增的序列与菌株 USDA 6T具有高度的同源性，与其他菌株不同源或同源性很低，使用该引物可以将5873 和 USDA 6T从其他菌株中区分出来。为进一步区分，利用引物 4-4、Q1 及上述两对混合引物，同时扩增高度同源的 5873 和 USDA 6T，以有效慢生根瘤菌USDA 110T为对照，结果如图4所示，M123456789101112131415161718192021222324400200100bp300355 bpM146 4544 43 424140 3938 37 36 35 34 33 3231 3029 28 272625400100bp300BA A:M:2-Log ladder Marker.1:B.japonicum 5873;2:B.japonicum 5841;3:B.elkanii 5136;4:B.diazoefficiens 5119;5-17:B.japonicum 5821,5129,4892,5452,5599,5016,5437,4129,4470,4530,4438,5547,5248;18:S.fredii 4475;19:R.alamii 4370;20-24:B.japonicum 5876,4784,5528,5412,5260.B:M:2-Log ladder Marker.1:B.japonicum 5873;25:B.diazoefficiens USDA 110T;26:B.japonicum 5665;27:S.fredii USDA 205T;28-33:B.japonicum 5588,4503,5039,4248,5240,5190;34-35:B.elkanii 5109,5161;36-45:B.japonicum 5742,4855,4794,4291,4698,5128,4770,4296,4207,4543;46:B.japonicum USDA 6T 图 3 特异性引物 4-4 筛选结果 Fig.3 PCR results of No.4-4 primer specificity(355 bp)2756 中 国 农 业 科 学 56 卷 13：引物为4-4 The primer is 4-4；46：引物为Q1 The primer is Q1；79：4-4 与 Q1 混合引物 The mixed primers of 4-4 and Q1；M：DL1000 ladder Marker；1、4、7：B.japonicum 5873；2、5、8：B.japonicum USDA 6T；3、6、9：B.diazoefficiens USDA 110T 图 4 不同特异性引物扩增结果 Fig.4 PCR results of different primers 使用引物 4-4 时，仅 5873 和 USDA 6T可扩增出 355 bp左右的条带；使用引物 Q1 时，5873 可扩增出长度为218 bp 左右的条带，而 USDA 6T和有效慢生根瘤菌USDA 110T均扩增出 269 bp 左右的条带。因此，引物4-4 和 Q1 复合使用，可通过检测目的条带的有无（355和 218 bp），实现大豆根瘤菌 5873 的快速检测。2.2 PCR 条件/体系优化和验证 2.2.1 PCR 条件的优化 以大豆根瘤菌 5873 的基因组 DNA 为模板，建立 PCR 反应体系并进行优化。结果表明，DNA 模板含量为 351 ng 时均有条带产生，但添加量为 15 ng 时条带开始变亮，所以体系模板DNA需15 ng以上（图5-A）；在引物浓度为10 molL-1时，添加均有产物形成，在添加 1.0 L 时条带较亮，从成本及引物二聚体问题考虑，选择添加最适引物量为 1.0 L（图 5-B）；退火温度在 5461 均有产物形成，但考虑到较高的退火温度有利于 PCR 反应的特异性，所以选择 61 作为最适的退火温度（图 5-C）。因此，通过优化条件，确定 4-4 引物 PCR 反应的最优体系为 Premix TaqTM 12.5 L，引物各 1.0 L，基因组DNA 15 ng 左右，加 ddH2O 补足至 25 L。扩增程序如图 5-D。25 L95 5 min预热Preheat变性Denaturation复性Renaturation延伸Extension延伸Extension保藏Preservation30 cycles30 个循环94 45 s61 45 s72 1 min10 min4 forever72 1M2345678355 bp400200100bp1M23456789101112400200100bp355 bp1M23456789101112355 bp400200100bpABCD M：2-Log ladder Marker。A：不同 DNA 浓度 Different concentrations of DNA templates。13：3 ng；46：15 ng；79：27 ng；1012：51 ng。B：不同引物浓度 Different dosages of primers。13：0.5 L；46：1.0 L；79：1.5 L；1012：2.0 L，10 molL-1 of each primer。C：不同退火温度 Different annealing temperatures。18：54、55、56、57、58、59、60、61。D：最适的扩增程序 Optimized amplification procedure 图 5 不同条件下大豆根瘤菌 5873 的 PCR 扩增产物及优化的扩增程序 Fig.5 Amplification products of B.japonicum 5873 under different conditions and the optimized amplification procedure 2.2.2 菌落 PCR 扩增验证 以大豆根瘤菌 5873 菌液为模板，用引物 4-4 进行菌落 PCR 扩增，可扩增到 355 bp 长的特异性片段。由此可以说明，以基因组 DNA为模板和以菌悬液为模板均可扩增出目的条带。因此，所建立的 PCR 快速检测方法是可行的。2.2.3 灵敏度检测 将大豆根瘤菌 5873 的菌悬液连 14 期 马鸣超等：大豆根瘤菌菌株 5873 PCR 快速检测方法的建立及应用效果评价 2757 续稀释 10 倍，以不同稀释梯度的菌液为模板，以最优 PCR 体系扩增。结果表明，PCR 反应体系含有超过 1 850 CFU/L 时能扩增 355 bp 的特异性条带。因此，所建立的 PCR 快速检测方法的灵敏限度是每微升反应体系达到 1 850 CFU 以上。2.2.4 目的条带验证 以大豆根瘤菌 5873 的总DNA 为模板，进行特异 PCR 扩增。将 PCR 产物纯化、连接、转化、筛选后，进行测序。其结果与大豆根瘤菌 5873 的特异片段相似性为 100%。2.3 特异 PCR 快速检测评价菌株 5873 竞争结瘤能力 对生长 40 d 后的对照组大豆根瘤数进行统计，接种菌株 5873 的根瘤数与其他菌株无显著差异（P0.05）。应用上述建立的特异 PCR 快速鉴定方法和BOX-PCR，对处理组的大豆根瘤进行 5873 占瘤率的测定，根据电泳条带计算占瘤率，结果见表 3，本研究建立的 PCR 快速检测方法和基于 BOX-PCR方法测定的大豆根瘤菌 5873 占瘤率一致，该方法可以成功地评价菌株 5873 竞争结瘤能力，方法可行。表 3 大豆根瘤菌 5873 占瘤率 Table 3 The nodule occupancy of B.japonicum 5873 占瘤率占瘤率 Nodule occupancy(%)复合接种复合接种 Co-inoculation 快速检测技术快速检测技术 Rapid identification BOX-PCRB.diazoefficiens USDA 110T+B.japonicum 5873 78.31.2 76.92.2 B.japonicum 5136+B.japonicum 587373.71.6 76.01.7 B.japonicum 5665+B.japonicum 587384.20.9 82.12.5 B.japonicum 5841+B.japonicum 587387.01.6 85.52.6 B.japonicum 5821+B.japonicum 587395.21.9 92.90.9 B.japonicum 5119+B.japonicum 587387.51.3 85.81.9 3 讨论 3.1 慢生大豆根瘤菌检测和鉴定技术 慢生根瘤菌属是大豆种植中应用最为广泛的菌种，起源于热带酸性土壤，被认为是所有根瘤菌的祖先，由于该属的菌种组成非常复杂，涉及各种类型的生态系统，属内种的确定与分类系统进展较为缓慢，分类仍然很复杂。此外，由于慢生根瘤菌属 16S rRNA基因的高度保守性，只有极少的物种进行了明确的鉴定16。目前对于慢生大豆根瘤菌的检测和鉴定，主要依靠传统的形态学分析、Biolog 生理生化鉴定、保守基因系统发育学分析、全基因组测序、平均核苷酸一致性比较、BOX-PCR 指纹图谱分析等多相分类技术7-17。但根据形态学、生理生化表型等实验和生物功能特征设计检测方法很难将近源种准确区分；而基于 16S rDNA、gyrB、rpoB 基因等保守序列的系统发育学分析方法只能鉴定到种属水平18-19。本研究建立的特异 PCR 快速检测技术是在目标菌株全基因组序列的基础上，根据菌株特异的碱基序列设计引物，并进行特异 PCR 扩增。通过目的产物的有无及大小，对目标微生物进行准确检测或鉴定。该技术具有特异性强、敏感度高、快速灵敏的优点，为微生物肥料根瘤菌等生产菌株的快速检测提供了重要参考。3.2 特异引物设计 特异引物的设计是特异 PCR 技术的关键环节，常见的特异引物设计方法包括：针对研究的特定菌株，从GenBank数据库中获取较常用的种属特异基因或功能基因，通过多重序列比对，进而确定引物序列29-30。例如，WU 等31基于 gyrB 基因序列设计引物，成功地利用特异引物扩增出胶质类芽孢杆菌519 bp的保守序列。而本试验并没有局限于特异基因或功能基因，而是通过对大豆根瘤菌 5873 的全基因组序列与 NCBI中已报道的大豆根瘤菌菌株序列进行全面的筛选与比对，从而实现在最大范围内检索菌株 5873 的特异序列，这样可有效促进特异的非编码序列被深度挖掘和发现。在设计的 20 对特异引物中，包含具有功能的编码基因以及基因间的非编码序列，本研究筛选的特异引物 4-4 为非编码序列。同样，本课题组王璇等32在建立胶质类芽孢杆菌 PCR 快速检测方法时，也是基于基因间的一段非编码序列进行了特异引物设计。由于在物种进化的过程中，大多数的编码基因具有进化保守性，尤其在与近源种进行比对分析时，其同源性相对较高。因此，在设计种内特异引物时，非编码序列可作为筛选的重要部分。引物设计时，其引物的长度一般为 1830 bp，考虑到引物太短会提高错配率，导致引物缺乏特异性，而引物过长会导致其延伸温度过高，进而影响聚合酶的工作效率等原因，引物设计选择默认值 20 bp。引物序列的 GC 含量选择为 40%60%，过高或过低都会影响 PCR 反应的发生。此外，为避免产生二聚体及发夹结构，两引物之间不能存在互补结构，否则会降低引物的有效浓度。根据以上过程及原则，从 16 个同源性较低的 2 kb 的片段中，选择较好的 20 对引物进行 PCR 验证，建立快速检测方法。2758 中 国 农 业 科 学 56 卷 3.3 特异 PCR 方法的建立 虽然特异 PCR 技术鉴别大豆根瘤菌菌株的效果明显，但在建立 PCR 技术时，只是尽可能多的对与其相关的菌株进行特异性验证。为提高特异 PCR 的准确性，特异性验证时，应尽量多地选取近缘菌种作为参比菌株。本研究中，采用软件 OrthoANIu（https:/ ANI 计算发现，大豆根瘤菌 5873 的全基因组序列与模式菌株大豆根瘤菌USDA 6T的 ANI 值为 99.95%，上述两株菌亲缘关系很近33。引物 4-4 基本可以区分大部分的菌株，但遇到与其全基因组极其相近的菌株，还需通过全基因组序列比对等手段，找到其差异并将其区分。如通过上述两株菌的全基因组比较发现了 51 bp 特异性缺失序列，通过这段序列，设计了一段引物，以区分 5873与 USDA 6T。后续的验证中，使用引物 Q1 扩增分别得到长度为 218 和 269 bp 的扩增条带，正是缺失片段所致。此外，通过灵敏度试验，确定所建