PRLR基因多态性与深县猪繁殖性能的关联分析.pdf
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1、-196-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期PRLR基因多态性与深县猪繁殖性能的关联分析贾梦雨1,芦春莲1,李 尚1,宋佳纯1,李美杰1,桂若虹1,李 赛2,曹洪战1*(1.河北农业大学动物科技学院,河北保定 071000;2.河北正农牧业有限公司,河北辛集 052360)摘 要:实验旨在研究催乳素受体(PRLR)基因多态性对深县猪繁殖性能的影响。通过 PCR-RFLP 技术结合混合池一代测序技术检测基因多态性,并与 71 头深县猪的繁殖性能进行关联分析,结果显示PRLR基因外显子 8 有 2 个突变位点,分别为 A394G 和 A44
2、G 位点。A394G 位点上存在 AA、AG 和 GG 3 种基因型,其中AG 基因型个体的初生窝重显著高于 GG 基因型个体;A44G 位点上存在 AA、AG 和 GG 3 种基因型,其中AG 基因型个体的总产仔数显著高于 GG 基因型个体。各位点皆为错义突变,且均处于 Hardy-Weinberg 平衡状态(P0.05)。因此,PRLR基因多态性与深县猪的繁殖性状显著相关,可作为深县猪分子遗传育种的候选基因。关键词:深县猪;PRLR;多态性;繁殖性能中图分类号:S828.2 文献标识码:A DOI 编号:10.19556/j.0258-7033.20220510-08研究表明,猪的繁殖性能
3、具有低遗传力特点,且遗传力在 0.150.20 之间1。传统育种方法结合相关的标记辅助选择及标记辅助渗透等一系列方法在猪育种中发挥了重要作用。深县猪具有抗逆性强、耐粗饲等特点,在恶劣环境及较差饲养管理条件下仍能正常生长发育。20世纪 60 年代至 90 年代末,深县猪全产区基础母猪存栏量和养殖数量急剧下降,只有少数个体分布在河北各地,直至 21 世纪初在宁晋、吴桥、景县、武强、新河、饶阳、肃宁等地找到了具有理想体型外貌特征的 47 头深县猪,其中公猪 11 头,母猪 36 头,以此为基础建立了深县猪基础群2。由于深县猪还在保种阶段,急需找到合适的分子标记并结合传统育种手段来扩大群体规模。催乳素
4、受体(PRLR)最早在乳腺组织中被发现,属于催乳素受体超家族3。此外,在哺乳动物生殖系统也存在PRLR基因表达4。PRLR是催乳素(PRL)的特异性受体,通过与 PRL 结合调控雌性动物繁殖性能,是影响母猪繁殖性能的主效基因之一5。Hu 等6研究表明,猪的PRLR基因中包含9个内含子和10个外显子,其中外显子 10 含有较多的突变,呈现多态性,并与猪的繁殖性能密切相关。截至目前,国内外学者对PRLR基因的多态性与猪繁殖性状的关联性进行了大量研究工作,取得了理想的结果,如曹果清等7采用 PCR-RFLP技术检测大白猪、马身猪、山西黑猪和山西白猪 4 个品种(系)221 个个体PRLR基因第 10
5、 外显子的多态性,并采用单变量动物模型分析多态位点对母猪产仔性能的影响,结果表明PRLR基因第 10 外显子存在 Nae I 多态位点,在 4 个猪种中均检测到 A、B 2 个等位基因和AA 和 AB 2 种基因型,其中 AA 型母猪的头胎产仔数和产活仔数分别比 AB 型高 1.797 头和 1.293 头。因此,PRLR是一个十分理想的候选基因。目前,对候选基因的研究报道虽然很多,但由于猪的品种不同,影响也不尽一致。因此,本实验主要对主效基因PRLR基因进行多态性检测,并分析其多态性与深县猪繁殖性状的关联性,应用候选基因的分子标记来筛选出繁殖性能高的母猪,为深县猪的分子育种提供理论依据。1
6、材料与方法1.1 实验动物 本研究实验动物来自河北正农牧业有限公司,选取 71 头经产第 4 胎深县母猪,在同一环境下用相同的饲养模式进行管理。由于深县猪处于保种阶段,规模较小,在仔猪出生后测定了 71 头深县母猪的繁殖性能,包括总产仔数、产活仔数、初生窝重、21 日龄收稿日期:2022-05-11;修回日期:2022-05-20资助项目:河北省生猪产业技术创新体系(HBCT2018110203)作者简介:贾梦雨(1997-),女,河北石家庄人,硕士,主要从事动物遗传育种研究,E-mail:*通讯作者:曹洪战(1970-),男,河北衡水人,博士,教授,主要从事动物遗传育种研究,E-mail:-
7、197-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 窝重和断奶窝重(30 日龄)。首先通过 PCR-RFLP 技术结合一代测序技术分析候选基因多态性,与繁殖性能进行关联分析,确定深县猪的优势基因型,并将 2 个位点合并与繁殖性能关联分析,确定优势合并基因型。1.2 组织样品采集 仔猪出生后,用耳缺钳采集 71 头深县母猪耳组织样,浸泡于 75%的酒精溶液中,带回实验室后放入-20冰箱用于基因组 DNA 提取。1.3 实验方法1.3.1 基因组 DNA 的提取 按照 Ezup 柱式动物基因组DNA 提取试剂盒说明书提取耳组织 DNA,用 1%的
8、琼脂糖凝胶电泳检测纯度,用紫外分光光度计法测定浓度后稀释至 100 ng/L,将繁殖性能差距较大的 20 份 DNA样品各取 5 L 混合在一起,构成 DNA 混合池,-20保存备用,用于初步筛选深县猪PRLR基因的 SNPs 位点。1.3.2 引物设计与合成 根据 NCBI 中PRLR基因序列(基因 ID:414916)使用 SnapGene 软件设计外显子的扩增引物,并使用 NCBI-Blast 检测引物特异性,交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。SNP 位点通过序列比对寻找。引物序列信息见表 1。1.3.3 PCR 扩增、测序及序列比对 PCR 反应体系 25 L:DNA 混合池样
9、品(100 ng/L)3 L,2Taq MasterMix 12 L,上、下游引物(10 mol/L)各 1.5 L,去离子水 7 L。反应程序:94预变性 2 min;94变性 30 s,退火 30 s(退火温度见表 1),72延伸 30 s,35 个循环;72终止延伸 10 min。PCR 产物经琼脂糖电泳检测合格后,根据 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒进行胶回收,回收产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,并通过 MegAlign 软件进行比对分析。1.3.4 RFLP 酶 切 分 型 PCR 反 应 体 系 20 L:样 品DNA(100 ng/L)1 L,2Ta
10、q MasterMix 10 L,上、下游引物(10 mol/L)各 1 L,ddH2O 7 L。PCR 扩增条件为:94预变性 5 min;94变性 30 s,退火30 s(退火温度见表 2),72延伸 30 s,35 个循环;72终止延伸 10 min。酶切体系:5 L PCR 产物、0.3 L 酶及 2 L Buffer,ddH2O 8.7 L,水浴2 h,温度见表2。酶切完成后,用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,并用凝胶成像分析系统拍照,根据电泳条带判断基因型。1.4 数据统计与分析 用 Excel 软件对基因频率和基因型频率的原始数据进行分析,计算多态信息含量(PolymorPhism I
11、nformation Content,PIC)、观测杂合度(Homozygosity,Ho)、遗传杂合度(Heterozygosity,He)和有效等位基因数(Effective Number of Alleles,Ne),并进行 Hardy-Weinberg 平衡检验;由于实验群体都为经产第 4 胎母猪,因而不受胎次和月龄影响,只考虑候选基因突变位点带来的效应。运用 SPSS 22.0 统计软件单因素方差分析法进行数据分析,并用 LSD 法对各位点不同基因型对经产母猪繁殖性能的影响分别进行显著性检验和多重比较,所有结果均使用“平均数 标准误”表示,在P0.05)。各位点的多态信息含量分别为0
12、.37、0.37,都为中度多态;杂合度分别为0.50、0.50;纯合度分别为 0.50、0.50;有效等位基因分别为1.98、1.99(表 4)。2.5 PRLR基因多态性与深县猪经产母猪繁殖性能的关联分析 如表 5 所示,PRLR基因外显子 8 的 A394G位点上,AG 基因型个体的初生窝重显著高于 GG 基因型个体,其余性状在不同基因型之间均无显著差异,但是总体呈现 AGAAGG 的趋势;A44G 位点上,AG基因型个体的总产仔数显著高于 GG 基因型个体。其余性状在不同基因型之间均无显著差异(P0.05),总体呈现 AGAAGG 的趋势。2.6 合并基因型与深县猪初产高繁母猪繁殖性能的
13、关联 分 析 如 表 6 所 示,将 A394G 和 A44G 2 个 位 点进行合并分析,得到 9 种基因型:AAAA、AAAG、AAGG、AGAA、AGAG、AGGG、GGAA、GGAG、GGGG 基因型。GGAA 基因型的产活仔数和初生窝重显著高于 AAAA 基因型,而 AGGG 基因型的 21 日龄窝重和断奶窝重显著高于 AAAA 基因型。3 讨 论对于PRLR基因的Alu I 酶切位点研究较多,如在金华猪的优势等位基因为 A 等位基因8,藏猪 A 等位基因频率为 0.668 39,长白、大白和杜洛克的 A 等位基因频率分别为 0.437 5、0.455 6 和 0.478 210,保
14、山猪的A 等位基因频率为 0.652 811,松辽黑猪等位基因 A 的频率为 0.55112,圩猪和定远猪等位基因 A 的基因频率分别为 0.709 1 和 0.706 313,皖南花猪的 A 等位基因频率为 0.783 4,皖南黑猪 A 等位基因频率为 0.705 914。由此可见,此位点的 A 等位基因频率在地方猪种中较高,而在引进猪种中 B 等位基因的频率较高。本实验在PRLR基因中检测到 A394G、A44G 2 个多态位点,任丽群15在宗地花猪的PRLR基因中发现 6 个 SNPs位点,分别为 C1115G、A1528T、G1600A、C1620T、A1283C 和 A1789T,其
15、中 A1789G 与本实验检测到的A394G 位点相同,A1789G 位点上,M 为优势等位基因,MN 为优势基因型。A394G 位点上优势等位基因为A 等位基因,优势基因型为 AG 基因型,与 A1789G 位点的研究一致。谢晶晶16在 3 个品系大白猪中检测到与本文一致的位点 A934G 和 A584G,A934G 位点上 A等位基因是优势等位基因(0.535),AT 基因型是优势基因型(0.482);A584G 位点上 A 等位基因是优势等位基因(0.687),AG 基因型是优势基因型(0.468),与本实验结果均一致。孙菊英等17将嵊县花猪PRLR基因Nae I 酶切位点的多态性与繁殖
16、性能进行关联分析,结果发现第 10 胎中AA 基因型的产活仔数和断奶仔数显著高于 AB 基因型母猪,但是 AA 型母猪断奶窝重极显著低于 AB 型母猪。图 6 PRLR基因 A44G 位点不同基因型的测序峰图M:DL 600;泳道 1、5、7:AG 基因型;泳道 2、3、4:GG 基因型;泳道 6:AA基因型。图 5 PRLR基因 A44G 位点的 PCR 扩增图和酶切图AGAAGAGGAGGAGAAGGAGAGG 基因型AG 基因型AA 基因型M1234567bp60050040030020010021415856B-200-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年
17、第 59 卷 第 08 期任丽群15在宗地花猪 A1789G 位点上发现 MM 基因型的总产仔数最高。谢晶晶16在大白猪中发现 A934G 位点的 AA 基因型能显著提高产仔数;A584G 位点上,丹系大白猪 AG 基因型的繁殖性能最高,美系大白猪为AA,加系大白猪为 GG。而本实验中,A394G 位点上AG 基因型的初生窝重显著高于 GG 基因型个体,而且此位点的 AG 基因型还能显著提高初产高繁群体母猪的总产仔数和产活仔数;A584G 位点丹系大白猪与本实验结果相同。可能是由于猪种的不同导致了研究结果的差异。邱梅玉等18将ESR与ITGB1基因 2 个 SNP 位点组合,探讨其对大白猪产仔
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