不同碘水平甲状腺乳头状癌患者血清外泌体差异miRNA的筛选.pdf
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1、MODERNONO31,No.23.43512023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期不同碘水平甲状腺乳头状癌患者血清外泌体差异miRNA的筛选罗晓婷,张琳琳,刘庆华3,张辉4,邢浩”,尹峰燕,何倩,孔伟,邢薇佳1山东第一医科大学公共卫生与健康管理学院,山东济南2 50 0 0 0;成武县人民医院普外科,山东菏泽274000;山东第一医科大学第二附属医院检验医学科,山东泰安2 7 10 0 0;泰安市中心医院检验医学科,山东泰安2 7 10 0 0;泰安市中心医院甲状腺外科,山东泰安2 7 10 0 0;山东第一医科大学第二附属医院甲状腺外科,山东泰安2 7 10 0 0【摘要】目的:通
2、过研究甲状腺乳头状癌(papillarythyroid carcinoma,PTC)患者和健康人的血清外泌体miRNA在不同碘水平下的表达谱差异,探寻不受高碘影响可稳定诊断PTC的生物标志物。方法:收集PTC患者和健康人的血清样本,采用砷铈催化分光光度法测定血清碘,分别纳入高碘、正常碘的PTC患者各10例,高碘、正常碘的健康人各5例作为研究对象。然后从血清中抽提外泌体,从中提取miRNA并进行高通量测序,进一步做基因本体论(gene ontology,G O)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclope-dia of genes and genomes,KEGG)通路分析
3、。结果:分别筛选高碘、正常碘组中PTC患者与健康人的差异表达miRNA,再取交集得到12 个共同差异表达miRNA,显著富集到6 个PTC相关通路。结论:与健康人对比,PTC患者中下调的miR-3158-3p、m i R-18 6-5p,上调的miR-122-5p、m i R-37 5-3p m i R-10 a-5p、m i R-10 b-5p m i R-148 a-3p、m i R-2 2 3-5p、l e t-7 d-3p、m i R-6 51-5p,这10 个miRNA可以作为在一般人群中区别PTC患者和健康人的稳定潜在生物标志物。【关键词】甲状腺乳头状癌;高碘;外泌体;miRNA;
4、生物标志物【中图分类号】R736.1【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.23.010【文章编号】16 7 2-49 9 2-(2 0 2 3)2 3-4351-0 6Screening of differential miRNA in serum exosomes of patients with papillary thyroid car-cinoma with different iodine levelsLUO Xiaoting,ZHANG Linlin,LIU Qinghua,ZHANG Huit,XING Hao,YIN Fengyan
5、,HE Qian,KONG Wei,XINGWeijiaSchool of Public Health and Health Management,Shandong First Medical University,Shandong Jinan 250000,China;Department ofGeneral Surgery,Chengwu Hospital,Shandong Heze 274000,China;Department of Laboratory Medicine,the Second Afiliated Hospital ofShandong First Medical Un
6、iversity,Shandong Taian 271000,China;Department of Laboratory Medicine,Taian City Central Hospital,Shandong Taian 271000,China;Department of Thyroid Surgery,Taian City Central Hospital,Shandong Taian 271000,China;Departmentof Thyroid Surgery,the Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical U
7、niversity,Shandong Taian 271000,China.Abstract)Objective:To explore biomarkers that can stably diagnose papillary thyroid carcinoma(PTC)withoutthe influence of high iodine,the expression profiles of serum exosomal miRNA in patients with PTC and healthy sub-jects at different iodine levels were studi
8、ed.Methods:Serum samples from PTC patients and healthy people were col-lected,and serum iodine was determined by catalytic spectrophotometry.PTC patients with high iodine and normaliodine were 10 cases respectively,and healthy people with high iodine and normal iodine were 5 cases respectively.Then,
9、exosome was extracted from serum.MiRNAs of exosome were extracted and performed by high-throughputsequencing.Bioinformatics analysis of target gene was done by method of gene ontology(GO)and Kyoto encyclopediaof genes and genomes(KECG).Results:The differential-expressed miRNAs of PTC patients and he
10、althy people inthe high iodine and normal iodine groups were screened separately.They were intersected from these two groups to obtain12 common differential-expressed miRNAs,which were significantly enriched to 6 pathways related to PTC.Conclu-sion:Compared with healthy people,miR-3158-3p and miR-18
11、6-5p are down-regulated in PTC patients,andmiR-122-5p,miR-375-3p,miR-10a-5p,miR-10b-5p,miR-148a-3p,miR-223-5p,let-7d-3p,【收稿日期】20230530【修回日期】2 0 2 3-0 7-2 1【基金项目】山东省医药卫生科技发展计划(编号:2 0 2 2 12 0 50 538)【作者简介】罗晓婷(19 9 6 一),女,广东中山人,硕士在读,主要从事甲状腺恶性肿瘤方向研究。E-mail:c a r o l i n e 58 52 16 3.c o m【通信作者】邢薇佳(19 8
12、 3一),女,山东泰安人,教授,主要从事慢性病流行病学研究。E-mail:w j x i n g s d f m u.e d u.c n4352不同碘水平甲状腺乳头状癌患者血清外泌体差异miRNA的筛选罗晓婷,等miR-651-5p are up-regulated.These 10 miRNAs can be used as stable potential biomarkers to distinguish PTCpatients from healthy individuals in the general population.Key words papillary thyroid c
13、arcinoma,high iodine,exosome,miRNA,biomarkerModern Oncology 2023,31(23):4351-4356根据世界卫生组织发布的2 0 2 0 年数据,全球甲状腺癌(t h y r o i d c a n c e r,T C)新发病例为58.6 2 万例,发病率位列所有癌症的第9 位,其中全球女性发病率为10.1/10 万,是男性的4倍。TC近年发病率一直不断上升,特别是甲状腺乳头状癌(papllarythyroidcarcinoma,PTC)迅速增加,占所有TC的8 0%以上2。在临床诊断上,常规超声检查操作简便且检出率极高,但其仅从结
14、节的形态学角度评价,客观的定量评价指标不足,诊断敏感性及特异性较低3;CT检查可有效诊断和评估PTC扩散情况,但对于病灶直径小于5mm的微小癌变,漏诊概率非常高4;超声引导下细针抽吸活组织检查(fineneedleaspirationbiopsy,FNA B)为最常用的PTC术前确诊手段,然而其属于侵人性的有创诊断方法,并且严重依赖于操作人员的技能和经验5-6。因此,传统诊断方法的单一使用不利于PTC 临床诊断的及时性和准确性。近年来研究发现,外泌体miRNA是多种癌症的早期诊断、抑制治疗、疾病预后的生物标志物7-8。外泌体具有独特的双层脂膜的囊泡结构,可以保护内部miRNA的稳定性。miRN
15、A是一系列长度为18 2 5个核苷酸,为内源性、单链的非编码RNA。m i RNA 的失调会调控肿瘤细胞分化、迁移、凋亡、增殖等生物学过程,这些调控过程可以是特定miRNA的过度表达或不足表达,进而影响致癌或抑癌基因的表达9。因此,血清外泌体miRNA可以作为PTC传统诊断方法外的一种非侵入性的早发现及辅助性诊断方式。此外,高碘暴露与甲状腺结节有密切关系,研究表明其是TC的独立危险因素10,但目前碘对TC的影响机制尚不清楚,且目前关于碘调控与PTC 相关的miRNA的研究并不多。金明月等人【通过体外实验研究发现碘会促进miR-21/221/222的表达上调,并进一步调控PI3KA K T 信号
16、通路中蛋白的表达来影响PTC发展。WANG等人12 1发现高碘通过调控miR-422a和MAPK1通路促进TC的发生。因此,在中国已基本消除低碘人群的前提下,本研究综合考虑了高碘这一因素对PTC患者和健康人群的miRNA调控的影响,找出在不同碘水平下都能稳定鉴别PTC和健康人的共同miRNA。1资料与方法1.1研究对象本研究选取山东第一医科大学第二附属医院和泰安市中心医院在2 0 2 1年10 月至2 0 2 2 年0 7 月收治T,分期的高碘、正常碘PTC患者各10 例纳人研究,选取与病例组匹配的高碘、正常碘健康人各5例作为对照组。不同碘水平组年龄、性别、淋巴结转移情况均没有统计学差异纳人标
17、准:PTC患者根据2 0 2 1版NCCN甲状腺癌诊疗指南确认为TC患者,并经FNAB病理证实为PTC患者;PTC患者均为首次治疗,血样采集前未接受根治手术、化疗、放疗等相关治疗;对照组是与PTC患者同期人院进行体检的健康人群。排除标准:有2 个及以上原发部位肿瘤的患者或其他部位肿瘤的患者;甲状腺功能五项指标异常、有甲状腺相关疾病(如甲状腺肿、结节等)的健康人;研究对象采集血样前2 4小时进食含碘量高的食物。本研究已获得山东第一医科大学伦理评审委员会的批准,所有研究对象均知情同意。1.2血样采集采集所有研究对象早晨空腹静脉血,在室温静置12 h,常温下150 0 g离心10 min收集淡黄色上
18、清液,然后42000g离心30 min除去细胞和碎片,取血清置于1.5mL无RNA酶的EP管,-8 0 保存备用。1.3血清碘含量测定采用国家卫生行业标准血清中碘的测定一砷铺催化分光光度法(WS/T572-2017)进行单次的血清碘含量测定。根据世界卫生组织提出的碘代谢参考范围,血清碘45 9 0g/L为正常碘人群,大于9 0 g/L为高碘人群131.4血清外泌体的提取和鉴定在2 5水浴中解冻血清,取1mL血清样品于EP管中,加人2 0 0 mL血清总外泌体分离试剂(ThermoFisherScientific公司),上下旋转充分混合,置于2 8 培育30 min。培育后,室温10 0 0 0
19、 g离心10 min,吸弃上清液。用10 0 LPBS溶液冲洗沉淀,并用移液枪反复吹打至沉淀溶解,制成外泌体原液,置于-8 0 储存。采用透射电子显微镜观察外泌体,外泌体粒径检测法测量颗粒直径1.5外泌体RNA的提取采用Trizol法提取外泌体原液中的总RNA,通过Agilent2200TapeStation电泳工作平台检测RNA浓度和完整性,采用ND-1000Nanodrop分光光度仪检测RNA的纯度,最后将提取的RNA样品分装置于EP管,-8 0 存储。1.6miRNA文库制和高通量测序用质检通过的RNA提取液进行RNA文库构建,加人3接头、5接头和反转录引物,反转录合成互补单链cDNA,
20、再进行PCR扩增。通过Qubit荧光计定量仪和Agilent2200TapeStation平台检测RNA的完整性和质量控制。使用Illu-minaHiSeq2000平台对RNA进行高通量测序分析。1.7miRNA测序数据处理和生物信息学分析去除两端接头,保留片段长度为18 32 nt长度的数据,对测序序列过滤筛选高质量的目标洁净数据,并与参考基因组比对,获得全基因组数据。通过R包DESeq2分别对高碘组、正常碘组中PTC患者与健康人的已知miRNA表达量差异进行统计学分析,通过分别筛选两组中Ilog2(f o l d c h a n g e)I1,且P 1,P0.05;在正常碘组,PTC患者与
21、健康人群的差异表达miRNA共9 1个。高碘组和正常碘组的差异miRNA火山图见图2 A,层次聚类热图见图2 B。AHighiodineNormaliodinemiR-3158-3pmiR-3158-3p4-4let-7d-3pmiR-job-5p let-7d-3pmiR-10b-5pmiR-223-5pmiR-9-3p3miR-186-5pmiR-651-3pmiR-10a-5pmiR-548ar-3pmiR-548ar-3p miR-joa-pmiR-148a-3piR-651-5pmiR-148a-3p2miR-122-5p2miR-223-5piR-122-5pmiR-186-5pm
22、iR-375-3pnsiR-375-31100-50505log.FClog,FCHighiodineNormaliodineBmiR-122-5gmiR-148a-miR-iob-5pmiR-iOa-SpIct-7d-3Piet-7e-SpmiR-186-5PmiR-223-5PmR-126-5PmR-370-39mR-1301-5pmiR-3158-3pmiR-1Oa-3PmiR-651-3PmR-450b25pmR-375-3PmiR-3135bmiR-301e-5pmiR-1255aValueValuemiR-9-3PmiR-548au-5p5p2-0miR_548g-3p2let-7
23、e-3pmiR-548aq-3P1miR-548ah-3pmiR-548p0-1R-15a-225p-223miR-4516miR-873-3gmiR-1910-3pmmiR-6763-5pmmiR-379-3PmiR-372-3PmmmmmiR-516a-5pmiB-2115-5pmMR-377-3PmmmiR-933mmiR-6861-5g.miR-10392-5miR-1233-5pPmiR-6810-SPmiR-664-3PmiR-6734-3PmiR-200a-5pmR-580-3PmiR-548ar-3pmiR-1321234856工工工工PPPPPPPP图2高碘组和正常碘组差异m
24、iRNA的表达水平A:高碘组和正常碘组的火山图;B:高碘组和正常碘组聚类热图。P为PTC患者,C为健康人。Fig.2The expression levels of dferential miRNAs in high and normal iodine groupsA:Volcanic plots of high and normal iodine groups B:Clusterheat maps of high and normal iodine groups.P is for PTC patients,C is for healthy people.2.3高碘组和正常碘组两组交集共有的差
25、异表达miRNA将高碘组、正常碘组的差异表达miRNA进行交叉比对,可筛选出12 个共同差异的miRNA(表1)。其中在高碘和正常碘组中,与健康人群相比,PTC患者均上调的miRNA有8个,均下调的miRNA有2 个;PTC患者在高碘和正常碘组表达方向相反的有2 个。4354不同碘水平甲状腺乳头状癌患者血清外泌体差异miRNA的筛选罗晓婷,等表1高高碘组和正常碘组共同的差异表达miRNA的比较Tab.1The comparison of the common differential-expressed miRNAsbetween the high and normal iodine grou
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