不同雌激素浓度对重组人骨形态发生蛋白2干预乳腺癌MCF-7细胞生长和迁移影响的体外研究.pdf
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1、2023年6 月第2 7 卷第6 期中国实验诊断学705文章编号:10 0 7 42 8 7(2 0 2 3)0 6 0 7 0 511不同雌激素浓度对重组人骨形态发生蛋白2 干预乳腺癌MCF-7细胞生长和迁移影响的体外研究刘书中,姚思远1,吴昀效?,刘勇1*(1.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科,北京10 0 7 30;2.北京大学公共卫生学院,北京10 0 191)摘要:目的探究不同雌激素浓度对rhBMP-2干预下乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响。方法本实验根据处理MCF-7细胞的rhBMP-2、n o g g i n(BM P-2 拮抗剂)以及不同雌激素浓
2、度将细胞进行分组。采用MTT试验检测不同作用条件下MCF-7细胞的增殖能力,Transwell迁移试验及侵袭试验评估不同作用条件下细胞迁移及侵袭能力,利用流式细胞仪检测细胞周期并应用qRT-PCR技术对细胞周期蛋白水平进行定量分析。结果较低浓度的雌激素对rhBMP-2干预后的MCF-7细胞增殖有抑制作用,而高浓度的雌激素对rhBMP-2干预后的MCF-7细胞增殖有促进作用。不同浓度的雌激素均可促进rhBMP-2干预后MCF-7细胞的迁移,其中部分浓度具有统计学意义。不同浓度的雌激素对于rhBMP-2干预后MCF-7细胞的侵袭能力有抑制趋势,但均无统计学差异。RhBMP-2和noggin可不同程
3、度影响G1期,不同雌激素浓度对细胞周期并无显著性影响。不同浓度雌激素处理下基因CDK2、CDK4、c y c l i n D 1、c y c l i n E、p 2 1转录水平有所差异。结论低浓度的雌激素可协同rhBMP-2对乳腺癌MCF-7细胞增殖产生抑制作用,而高浓度雌激素则拮抗了rhBMP-2对MCF-7细胞增殖的抑制作用。在rhBMP-2作用的基础上,雌激素可进一步降低MCF-7细胞的迁移能力,但对侵袭能力作用无明显统计学差异。不同雌激素浓度对细胞周期并没有显著影响,但可能影响多种细胞周期蛋白的表达。关键词:雌激素浓度;重组人骨形态发生蛋白2;乳腺癌;细胞增殖;迁移和侵袭中图分类号:R
4、737.9文献标识码:AIn vitro study on the effects of different concentrations of estrogen on the growth and migration of breast cancer MCF-7nantc.nrotein-2LTLTAAWIziao,et al.(1.Department of Orthopaedics,Peking Union Medical College Hospital,CAMS&PUMC,Beijing100730,China;2.School of Public Health,Peking Uni
5、versity Health Science Center,Beijing 100191,China)Abstract:Objective To explore the effects of different concentrations of estrogen on the proliferation,migration,invasion and cell cycle of breast cancer MCF-7 cells under the intervention of rhBMP-2.Methods In this study,MCF-7cells were divided int
6、o groups according to the different concentrations of rhBMP-2,noggin(BMP-2 antagonist)and es-trogen.MTT assay was used to detect the proliferation ability of MCF-7 cells under different conditions.Transwell mi-gration test and invasion test were used to evaluate the migration and invasion ability of
7、 MCF-7 cells under differentconditions,flow cytometry was used to detect the cell cycle,and qRT-PCR was used to quantitatively analyze the ex-pression level of cyclins.Results Low concentration of estrogen can inhibit the proliferation of MCF-7 cells after rh-BMP-2 intervention,while high concentrat
8、ion of estrogen can promote the proliferation of MCF-7 cells after rhBMP-2intervention.Different concentrations of estrogen can promote the migration of MCF-7 cells after rhBMP-2 interven-tion,some of which have statistical significance.Different concentrations of estrogen inhibited the invasion of
9、MCF-7cells after rhBMP-2 induced,but there was no significant difference.RhBMP-2 and noggin could affect G1 phase in var-ying degrees,but different concentrations of estrogen had no significant effect on cell cycle.The transcription levels ofCDK2,CDK4,cyclin D1,cyclin E and p21 were regulated by dif
10、ferent concentrations of estrogen.Conclusion Low con-centration of estrogen can cooperate with rhBMP-2 to inhibit the proliferation of breast cancer MCF-7 cells,while highconcentration of estrogen can antagonize the inhibitory effect of rhBMP-2 on the proliferation of MCF-7 cells.On thebasis of rhBM
11、P-2,estrogen can further reduce the migration ability of MCF-7 cells,but there is no significant difference基金项目:北京协和医学院博士生创新基金项目(2 0 18-10 0 2-0 2-0 8);2 0 2 2 年第一批协和青年学者”支持计划;2 0 2 1年“骨质疏松和骨矿盐中青年医生优才培养计划暨白求恩石药骨质疏松科研基金项目”(GX2021D01)共同第一作者;*通讯作者ChinJLabDia2023,Vol27,No.6Te706in the invasion ability.D
12、ifferent concentrations of estrogen have no significant effect on cell cycle,but may affect the ex-pression of various cyclins.Key words:estrogen;rhBMP-2;breast cancer;cell proliferation;migration and invasion(Chin J Lab Diagn,2023,27:0705)骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)是生长因子超家族成员之一,迄今已经发现了30
13、多种BMP,其中应用最为广泛的是骨形态发生蛋白2(BMP-2)-2)。自2 0 0 2 年,重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)在美国已被广泛应用于骨不连、骨缺损、脊柱融合的手术治疗中且临床效果满意。但与此同时,rhBMP-2的临床应用是否会增加包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的患病风险也引发了学界的关注 3。此外,越来越多的研究证实了BMP通路在乳腺癌微钙化灶形成和上皮间质转化过程中的关键作用 4-5BMP-2参与多种生物学过程,如组织分化、细胞增殖与调亡、细胞功能调节等,并且在肿瘤的发生发展中亦扮演着重要角色 6-7。有证据表明BMP-2异常表达与乳腺癌发生和进展密切相关,BMP相关通路
14、在调节乳腺肿瘤细胞生物学功能方面以及调节肿瘤间质和骨转移微环境中发挥重要作用 8 。本团队前期研究已证实在体外条件下,以不同浓度的rhBMP-2处理细胞可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力,并增加G1期细胞所占比例、促进p21表达、抑制cyclinE表达,并显著抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化过程 9。在体内实验中rhBMP-2可减小瘤体体积,免疫组化检测显示rhBMP-2处理可显著降低瘤体组织中ki-67的表达水平 9值得注意的是,乳腺癌的发生和发展过程与人体内环境中的雌激素水平密切相关 10-1。AlSaleh等的研究表明沉默ER可使体内雌二醇增加伴随BMP-2过表达,并与乳腺癌上
15、皮-间质转化(EMT)过程相关 12 。Wang等研究发现BMP-2对MCF-7和MDA-MB-231细胞生长的抑制作用可被三苯氧胺拮抗,提示该作用与雌激素受体有关 13。不同的雌激素水平很可能在体内、体外条件下对rhBMP-2干预乳腺癌细胞的生物学行为产生进一步的影响,干扰甚至可能会逆转rhBMP-2对乳腺癌细胞的生物学作用。目前尚缺乏不同浓度雌激素对上述过程影响的论证结果,本研究拟探究不同浓度雌激素对rhBMP-2干预乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭以及细胞周期的影响。1材料和方法1.1材料人乳腺癌MCT-7细胞(由中国医学科学院基础医学研究所提供)、rhBMP-2(No v o p
16、r o t e i n,上海)、Noggin(Pr i me G e n e,上海)、雌激素(17-oes-tradiol)(Bi o G e m s,美国)。试验中使用的青霉素/链霉素溶液、胰蛋白酶、PBS缓冲液、MTT试剂、总RNA提取试剂盒、通用反转录试剂盒、实时定量PCR荧光定量试剂盒均购自索莱宝公司,无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司),胎牛血清、RPMI1640培养基及其他细胞培养试剂购自Gibco公司,Transwell嵌套、细胞培养板购自Corning公司,细胞周期检测试剂盒购自4ABiotech公司。1.2方法1.2.1细胞培养将人乳腺癌MCF-7细胞培养于含体积分数10%胎
17、牛血清、10 0 U/mL青霉素、10 0mg/L链霉素的RPMI1640培养基中,所有细胞在体积分数5%CO2的37 培养箱中常规培养,培养液每2 d或3d更换1次,当细胞长至8 0%铺满时消化传代。1.2.2细胞处理MCF-7细胞按适当密度铺板(第二天达8 0%汇合度),第二天换无血清培养基培养2 4h,然后加人BMP-2、雌激素或noggin处理2 4h。BM P-2 处理浓度为10 0 ng/ml;n o g g in 处理浓度为 10 0 ng/ml。1.2.3细胞分组根据处理MCF-7细胞的rh-BMP-2、n o g g in 以及不同雌激素浓度条件,将各处理组分为:(1)MCF
18、-7细胞十rhBMP-2;(2)M CF-7细胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol;(3)M CF-7 细胞十rhBMP-2十雌激素10-8 mol;(4)M CF-7 细胞+rhBMP-2+雌激素10-7 mol;(5)M CF-7 细胞+rhBMP-2+雌激素10-6 mol;(6)M CF-7 细胞;(7)MCF-7细胞noggin;(8)M CF-7 细胞+rhBMP-2+noggin。1.2.4MTT试验消化对数生长期细胞,在96孔板中接种细胞悬液(10 0 L/孔),将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37,5%CO2),并按以上分组进行处理。向每孔加人10 LMTT反应液,将
19、培养板在培养箱内孵育4h;吸走上清液,每孔加人10 0 L的DMSO振荡10 min,酶标仪测定在490nm处的吸光度。1.2.5Transwell迁移试验与侵袭试验首先细2023年6 月第2 7 卷第6 期中国实验诊断学707胞采用常规消化传代方法,制成细胞悬液,计数,调整浓度为2 10 5个/ml。将含10%血清的培养基加人培养板底部,上室加人2 0 0 L细胞悬液,继续在孵箱培养2 4h。4%多聚甲醛孔中进行固定。取出培养板,PBS清洗两次。10 0%甲醇室温固定2 0min后移到预先加入约7 0 0 L2.5%结晶紫溶液中,室温染色15min。PBS清洗、晾干后,使用荧光倒置显微镜完成
20、细胞计数并拍照保存。1.2.6河流式细胞仪检测细胞周期收集细胞,加人1ml冰浴预冷的PBS重悬细胞。1 ml细胞悬液与95%乙醇混匀后4固定12 h,10 0 0 r p m 离心3min,弃上清。加人5ml冰浴预冷的PBS重悬细胞,10 0 0 rpm离心3min,弃上清,配置PI染色液。染色:每管加人40 0 lPI染色液,涡旋,避光30min。上机检测(在激发波长48 8 nm波长处检测红色荧光)。1.2.7qPCR 试验R NA 提取:收集细胞沉淀,加人1mlTrizol,室温放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离。重复离心、去废液操作萃取RNA。逆转录反应:在冰浴的无RNase的离
21、心管中加人反应成分。7 0 保温5min后迅速在冰上冷却2min。将离心管置2 5温浴10 min,42 温浴6 0min。再于9 5条件下加热。终止反应后用RNaseFreeddH,O将反应体系稀释到2 0 0 l,取5l作为PCR反应模板。qPCR:根据合适条件配置反应体系,进行qPCR反应。以2-AACt法(Livak法)进行定量分析1.3主要观察指标体外试验中不同雌激素浓度对rhBMP-2干预下乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及相关mR-NA、蛋白的表达情况;体外试验中不同雌激素浓度对rhBMP-2干预下乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭和细胞周期的影响。1.4统计学方法采用SPSS22.0
22、软件(IBM公司,美国)进行统计学分析。本研究中获得实验数据以土s标准差的形式表示,应用样本t检验比较不同分组之间的统计学差异。以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1不同浓度雌激素对rhBMP-2作用下MCF-7细胞增殖能力的影响MTT试验结果表明rhBMP-2组、noggin组较对照组有统计学差异(P0.05),提示rhBMP-2、noggin均可抑制MCF-7细胞增殖见图1A。在不同浓度雌激素处理组与对照组的对比中,我们发现10-9mol与10-8 mol浓度的雌激素对rhBMP-2干预后的MCF-7细胞增殖有抑制作用(P0.05),10-7mol与10-6 mol浓度的雌激素对r
23、hBMP-2干预后的MCF-7细胞增殖有促进作用(P0.05),见图1B。110-1407*(%)4ITeAT100*120*王*90-100-王*AB8080rhBMP-2NogginrhBMP-2*:vs1,P0.05:rhBMP-2+NogginrhBMP-2+E2(10-)rhBMP-2+E2(10-)rhBMP-2+E2(10-7)rhBMP-2+E2(10-)图注:A.rhBMP-2、n o g g i n 对MCF-7细胞增殖的影响;B.不同雌激素水平对rhBMP-2干预下.MCF-7细胞增殖的影响图1MTT试验结果2.2不同浓度雌激素对rhBMP-2作用下MCF-7细胞迁移能力
24、的影响Transwell迁移试验结果提示rhBMP-2可减少MCF-7细胞迁移,noggin可促进MCF-7细胞迁移,rhBMP-2与noggin共同干预具有减少MCF-7细胞迁移的趋势,但并无统计学差异,见图2。在不同浓度梯度的雌激素作用下,Transwell迁移试验提示不同浓度的雌激素均可促进rhBMP-2干预后MCF-7细胞的迁移能力,其中浓度为10-9mol、10-8mol、10-7 m o l 时差异具有统计学意义(P0.05),见图3。ChinJLabDiag2023,Vol27,No.61e708250200-AB150-100-50-ErhBMP-2nogginrhBMP-2+
25、nogginD图注:A.NC组B.rhBMP-2组C.noggin组D.rhBMP-2+noggin组E.统计分析显示各组间无统计学差异图2Transwell迁移试验BC250200150100500DEF图注:A.rhBMP-2组B.rhBMP-2+10-9mol雌激素组C.rhBMP-2+10-8mol雌激素组D.rhBMP-2+10-7mol雌激素组E.rhBMP-2+10-6mol雌激素组F.统计分析显示部分浓度的雌激素水平对rhBMP-2干预下的MCF-7细胞迁移具有统计学意义图3Transwell迁移试验2.3不同浓度雌激素对rhBMP-2作用下MCF-7细胞侵袭能力的影响Tran
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