lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响.pdf
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1、基 础 研 究Experimental Research中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen Surg682IncRNA SNHG1 靶向 miR-7 对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响韩国雄1仲守泰李才茂马敏星1苏宏?青海省第五人民医院1放疗二科2 乳腺科3胃肠科(青海西宁8 10 0 0 0)【摘要】目的:探讨IncRNASNHG1通过miR-7对结直肠癌(CRC)细胞放疗抵抗的影响。方法:将CRC细胞 HT29 分为 ctrl 组、si-NC 组、si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibito
2、r-NC组、si-SNHG1+miR-7in-hibitor组,qRT-PCR检测细胞中SNHG1、m i R-7 的表达;克隆形成实验检测细胞放射敏感性;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot 检测细胞中 PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3、G LU T 1、HK2 的表达;双荧光素酶报告基因实验验证 SNHG1 与 miR-7 的关系。结果:与 ctrl 组、si-NC 组比较,si-SNHG1组的 HT29 细胞的 PE、SF、A 4g o 值、PCNA、G LU T 1、H K 2 表达明显降低(P0.05),细胞凋亡率、Bax、Ca s
3、p a s e-3表达明显上升(P0.05);与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组 HT29 细胞的 PE、SF、A 4s o 值、PCNA、G LU T 1、H K 2 表达显著升高(P0.05),细胞凋亡率、Bax、Ca s p a s e-3表达明显降低(P0.05);双荧光素酶报告显示,SNHG1靶向调控miR-7表达。结论:敲低 SNHG1可能通过靶向调控miR-7,进而改善 CRC的放疗抵抗。【关键词】SNHG1miR-7结直肠癌放疗抵抗克隆【中图分类号】R735.7【文献标识码】Adoi:10
4、.3969/j.issn.1009-9905.2023.03【文章编号】10 0 9-990 5(2 0 2 3)0 9-0 6 8 2-0 6Influence of lncRNA SNHG1 on radioresistance of colorectalcancer cells by targeting miR-7HAN Guo-xiong,ZHONG Shou-tai,LI Cai-mao,MA Min-xing,SU HongDepartment of Second Radiotherapy,Department of Breast,Department of Gastroen-te
5、rology,the Fifth Peoples Hospital of Qinghai Province(Xining 810000,China)ABSTRACT Objective:To investigate the influence of long non-coding RNA small nucleolarRNA host gene 1(lncRNA SNHG1)on the radioresistance of colorectal cancer(CRC)cells via miR-7.Methods:CRC cells HT29 were separated into:ctrl
6、 group(normally cultured HT29 cells),si-NCgroup(transfected with si-NC),si-SNHG1 group(transfected with si-SNHG1),si-SNHG1+in-hibitor-NC Group(co-transfected with si-SNHG1 and inhibitor-NC),and si-SNHG1+miR-7 in-【作者简介】韩国雄(198 3-11),男,青海西宁人,主治医师,研究方向:放疗。E-mail:a h q l u o 16 3.c o m【通信作者马敏星(198 2-0 1
7、),男,青海西宁人,博士,主治医师,研究方向:肿瘤放射治疗学及肿瘤相关蛋白糖基化。E-mail:韩国雄,等.lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响hibitor group(co-transfected with si-SNHG1 and miR-7 inhibitor);qRT-PCR was applied to detectthe expression of SNHG1 and miR-7 in cells;clonogenic assays were applied to detect cellular ra-diosensitivity;MTT assay
8、 was applied to detect cell proliferation;flow cytometry was applied to de-tect apoptosis;Western blot was applied to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA),Bcl-2-associated X protein(Bax),cysteine protease 3(Caspase-3),glucose transporter 1(GLUT1),hexokinase 2(HK2);and du
9、al-luciferase reporter assays were applied to verify the relation-ship between SNHG1 and miR-7.Results:Compared with ctrl group and si-NC group,the colonyformation rate(PE),survival fraction(SF),A4o value,PCNA,GLUT1,HK2 expression of HT29 cells insi-SNHG1 group were obviously decreased(P0.05),the ap
10、optosis rate,and the Bax,Caspase-3expression were obviously increased(P0.05);compared with si-SNHG1 group and si-SNHG1+in-hibitor-NC group,the PE,SF,A4co value,PCNA,GLUT1,HK2 expression of HT29 cells insi-SNHG1+miR-7 inhibitor group were obviously increased(P0.05),the apoptosis rate,and the Baxand C
11、aspase-3 expression were obviously decreased(P0.05);dual-luciferase reporter revealedthat SNHG1 targeted miR-7 expression.Conclusion:Knockdown of SNHG1 may improve the ra-dioresistance of CRC by targeting and regulating miR-7.KEY WORDS】SNH G 1.M i R-7.Co l o r e c t a l c a n c e r RadioresistanceCl
12、one683结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的其发病率和死亡率较高,严重威胁人们的生命健康安全 1-2 。目前治疗CRC主要依靠手术和放疗、化疗相结合的方法,但放疗抵抗常导致放疗失败,降低治疗效果 3-4。既往研究表明,长链非编码RNA(longnon-coding RNA,lncRNA)在CRC 放疗抵抗中具有重要调控作用 5-6 。在CRC细胞中检测到lncRNA SNHG1过表达,其显著促进了CRC细胞的上皮-间充质转化 7 。本研究通过生物信息学发现,SNHG1与miR-7可靶向结合,miR-7过表达显著抑制CRC细胞体外恶性生物学行为 8 。因此,本研究主要探究
13、SNHG1对CRC细胞放疗抵抗的影响以及其可能的分子机制。1材料和方法1.1主要材料和试剂人CRC细胞系HT29购自中科院上海细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司;兔源一抗PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、GLUT1、H K 2 均购自美国Ab-cam公司;LipofectamineTM2000Reagent 购自美国Invitrogen公司;si-SNHG1及 si-NC、m i R-7 i n h i b i t o r及 inhibitor-NC、m iR-7 m im ic 及 mimic-
14、NC,SNHG1及miR-7引物购自广州RiboBio公司。1.2细胞培养将HT29细胞置于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI1640培养基中,常规培养换液,收集对数期的细胞进行实验。1.3细胞转染及分组将对数期的HT29细胞分为ctrl组(正常培养的HT29细胞)、si-NC组(转染si-NC)、s i-SNH G 1组(转染 si-SNHG1)、s i-SNH G 1+inhibitor-NC 组(si-SNHG1 和inhibitor-NC 共转染)、si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组(si-SNHG1和miR-7inhibitor共转染)。1.4细胞照射条件采
15、用医用高能直线加速器对细胞进行体外照射,应用6 MV的X射线,照射野20cmx20 cm,源皮距10 0 cm,以3Gy/min的固定剂量率发射。1.5?qRT-PCR法检测SNHG1、mi R-7 表达使用Trizol试剂提取各组细胞中的总RNA,将RNA逆转录为cDNA后,以cDNA为模板上RT-qPCR仪进行扩增。引物序列见表1。分别以GAPDH、U 6 为内参,采用2-AACT计算细胞中SNHG1、mi R-7 的相对表达量。表1基因引物序列引物名称序列(5-3)SNHG1正向反向miR-7正向反向GAPDH正向反向U6正向反向1.6克隆实验检测细胞放射敏感性取对数生长期的细胞接种于6
16、 孔板中,每组分别给予细胞0、2、4、6、8 G y 的6 MVX射线照射,继续培养14d,甲醇固定,结晶紫染色,计数。克隆形成率(platingef-ficiency,PE)=克隆数/接种的细胞数10 0%,细胞存AGGCTGAAGTTACAGCTTTGGCTCCCTGTGTCTTTGGAAGACTAGTGATTTTGTTCCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTCCCTTCCGTGTCACTGCCTGCTTCACCACCTTCGCTCGCTTCGGCAGCACAGAGGTATTCGCAGAGGA中国现代普通外科进展2 0 2 3年9月第2 6 卷第9期活分数(survival frac
17、tion,SF)=PE实验组/PE对照组SNHG1+miR-7 inhibitor 组 HT29 细胞中 miR-7表100%,利用单击多靶模型拟合细胞存活曲线,SF=1-达降低(P 1表示敏感性增强,1则表示敏感性降低。1.7MTT法检测细胞增殖取各组细胞,调整密度接种到96 孔板中,培养过夜。分别将细胞培养2 4、48、7 2 h 后,避光加入MTT溶液,孵育4h,再加人DMSO。使用酶标仪检测吸光度(absorbance,A)。1.8流式细胞仪检测细胞调亡取各组HT29细胞,PBS洗涤后添加10 0 L结合缓冲液悬浮,再分别添加AnnexinV-FITC和PI染液5L,于室温下避光染色1
18、5min,使用流式细胞仪检测细胞凋亡。1.9Westernblot检测蛋白表达取各组对数期细胞,RIPA裂解缓冲液提取照射48 h后的HT29细胞总蛋白。采用电泳分离蛋白,10 0 V恒压转移至PVDF膜上,脱脂牛奶封(5%)闭2 h,将膜与一抗PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3、G LU T 1、H K 2、G A PD H,在4孵育过夜,再将膜与二抗室温下孵育2 h,弃去液体,加人ECL试剂观察蛋白质印迹,ImageJ软件评估蛋白的灰度值。1.10双荧光素酶报告基因实验构建SNHG1野生型质粒(SNHG1-WT)和突变型质粒(SNHG1-MUT),将 SNHG1-WT和SNH
19、G1-MUT分别与mimic-NC或miR-7mimic共转染于HT29细胞,48h后,检测荧光素酶活性。1.11统计学处理采用Graphpad Prism7.0软件。数据以x土s表示。单因素方差分析用于多组间的比较,进一步两组间的比较采用SNK-q检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1各组HT29细胞中SNHG1、mi R-7 表达比较与ctrl组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞中SNHG1表达降低、miR-7表达升高(P0.05);与 si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-ab工工si-SNHG1+inhibitor-
20、NC 组1.5si-SNHG1+miR-7inhibitor组工1.0ab0.5工0.0SNHG1图1各组HT29细胞中SNHG1、m i R-7 表达注:a:与ctrl组比较,P0.05;b:与si-NC组比较,P0.05;c:与si-SNHC1组比较,P0.05;d:与 si-SNHC1+inhibitor-NC组比较,P0.052.2各组HT29细胞放射敏感性情况比较在相同剂量照射条件下,与ctrl组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞SF、PE显著降低(P0.05);与si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-SNHG1+miR-7
21、inhibitor组细胞 SF、PE升高(P0.05)。见表2、图2 5。组别ctrl组si-NC组si-SNHG1组si-SNHGl+inhibitor-NC组si-SNHG1+miR-7inhibitor 组 1.6 38 0.48 7 1.346 0.42 8 0.6 11 0.7 54si-NC组150si-SNHG1组si-SNHG1+inhibitor-NC 组si-SNHG1+miR-7 inhibitor组cd100ab工)S500图2 各组HT29细胞放射敏感性的影响注:a:与ctrl组比较,P0.05;b:与si-NC组比较,P0.05;c:与si-SNHG1组比较,P0.
22、05;d:与si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,P0.05cdmiR-7表2 单击多靶模型参数Do/Gy Dq/GyNSF2kSER2.5471.2351.624 0.617 0.3932.486 1.069 1.537 0.583 0.4021.257 0.161 1.137 0.192 0.796 1.6351.1630.2551.245 0.2140.8601.518ctrl组cdab.工TTOGy2Gycdab.4Gycdab6Gy8Gyabcdctrl组si-NC组图3各组HT29细胞克隆形成情况(6 Gy)si-SNHG1 组si-SNHG1+inhibitor-NC
23、 组si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组韩国雄,等.lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响50厂2.0si-SNHGI组si-SNHG1+inhibitor-NC 组40si-SNHGl+miR-7inhibitor组cd工ab20工工100图4转染后对各组HT29细胞PE的影响注:a:与ctrl组比较,P0.05;b:与si-NC组比较,P0.05;c:与 si-SNHG1组比较,P0.05;d:与 si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,P0.052.3各组HT29细胞增殖能力比较与ctrl 组、si-NC组比较,si-SNHG1组H
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