重楼皂苷Ⅰ对紫外损伤的人永生化角质形成细胞(HaCaT)的保护作用研究.pdf
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1、【目的】研究重楼皂苷(polyphyllin,PP)对急性中波紫外线(mediumwaveultravioletrays,UVB)损伤的人永生化角质形成细胞(HaCaT)的保护作用及分子机制,为滇重楼在日化用品中的应用提供理论依据。【方法】采用四甲基偶氮唑蓝法检测不同浓度 PP处理 HaCaT 的存活率,筛选出无毒性 PP浓度;将 HaCaT 细胞随机分为 4 组:空白对照组、UVB处理组(21.6mJ/cm2)、0.250mol/LPP+UVB 处理组和0.500mol/LPP+UVB 处理组,采用结晶紫染色法探究 2 种浓度 PP对 UVB 处理后 HaCaT 细胞增殖的影响;采用蛋白质免
2、疫印迹法检测 HaCaT 细胞凋亡蛋白多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(polyADP-ribosepoly-merase,PARP1)、cleaved-PARP1、乙酰基-赖氨酸、K68 位点的线粒体超氧化物歧化酶重组蛋白(mitochondri-alrecombinantsuperoxidedismutase2,K68-SOD2)和沉默调节 3 蛋白(sirtuin3,SIRT3)的表达。【结果】与空白对照组相比,UVB 组的 HaCaT 细胞存活率显著下降,cleaved-PARP1 和 K68-SOD2 表达显著增加,而SIRT3 表达显著降低,造模成功。与 UVB 组相比,PP各剂量处理组可
3、提高 UVB 照射后 HaCaT 细胞的存活率,增加 SIRT3 的表达,降低 K68-SOD2 的乙酰化水平,进而减少凋亡蛋白 cleaved-PARP1 的表达,降低细胞的凋亡水平。【结论】PP可能通过增强 SIRT3 活性使 SOD2 去乙酰化,以增强 SOD2 活性,减轻 UVB 照射 HaCaT 细胞引起的氧化应激和凋亡,从而对 HaCaT 细胞起到保护作用。关键词:重楼皂苷;紫外损伤;人永生化角质形成细胞;去乙酰化酶中图分类号:S567.239.01文献标志码:A文章编号:1004390X(2023)04062106Study on the Protective Effect of
4、 Polyphyllinon HaCat CellsInjured by Ultraviolet RayGAOZiqi1,2,WANGDongxue2,WUSimin2,HUANGYewei2,MANJiaxu2,GAORuirui1,ZHANGDongying1,2(1.CollegeofScience,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;2.KeyLaboratoryofPuerTeaScience,MinistryofEducation,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,Ch
5、ina)Abstract:Purpose To study the protective effects and molecular mechanism of polyphyllin(PP)ontheHaCaTcellexposedtoacutemediumwaveultravioletrays(UVB)injury,providingatheoreticalbasisforapplicationofPPindailychemicalproducts.MethodsMethylthiazolyl云南农业大学学报(自然科学),2023,38(4):621626http:/JournalofYun
6、nanAgriculturalUniversity(NaturalScience)E-mail:收稿日期:2021-08-26修回日期:2023-04-13网络首发日期:2023-09-06*基金项目:国家自然科学基金项目(31760226);云南省重大科技项目(2018IA060)。作者简介:高梓琪(1996),女,湖南常德人,在读硕士研究生,主要从事营养代谢免疫学研究。E-mail:*通信作者 Correspondingauthor:张冬英(1976),女,湖南常德人,博士,教授,主要从事茶及特色植物资源开发利用研究。E-mail:网络首发地址:https:/ PPmay play a p
7、rotective role in HaCaT cells by enhancing SIRT3 activity,deacetylatingSOD2toenhanceSOD2activity,andalleviateoxidativestressandapoptosiscausedbyUVBirradiationofHaCaTcells.Keywords:polyphyllin;UVdamage;HaCaTcell;deacetylase随着生活水平的提高和医美行业的发展,皮肤外源性老化(如紫外损伤)的问题日益受到关注。日常生活中不可避免的日晒会导致皮肤细胞产生大量的自由基,引发细胞的氧化应
8、激,从而引起 DNA 损伤、线粒体等细胞器损伤、细胞内生物大分子过氧化和细胞外基质降解,宏观表现为皮肤红肿和晒斑等一系列老化现象,被称为皮肤光老化1。过量紫外线刺激角质形成细胞会产生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)。ROS 可诱导转录因子激活蛋白-1(activatorpro-tein1,AP-1),进而上调多种基质金属蛋白酶的表达水平从而降解大量的真皮胶原,使皮肤出现褶皱,黯淡无光泽2-3;ROS 还可以活化核转录因子核因子 B(nuclearfactorkappa-B,NF-B),进而上调促炎症细胞因子及各种黏附分子的表达,这些细胞因子又会上调 AP-1
9、并进一步激活 NF-B 通路,从而增强细胞的紫外损伤4-6。沉默调节 3(sirtuin3,SIRT3)则可以刺激线粒体超氧化物歧化酶重组蛋白(mitochondrialrecombinantsu-peroxidedismutase2,SOD2)的去乙酰化,进而清除紫外线导致的氧化应激7。重楼属植物是中国西南地区的特有植物资源,常被用于治疗炎症性皮肤病8-9,且其醇提物具备体外清除活性氧及抗氧化的功效10,重楼皂苷(polyphyllin,PP)作为其主要活性成分可以缓解 ROS 诱导的细胞自噬以减少细胞的氧化应激11,但是对于紫外线诱导的细胞损伤保护作用报道甚少。本研究探讨了 PP对紫外损伤
10、的人永生化表皮角质细胞(HaCaT)的保护作用及分子机制,旨在为深入开发滇重楼资源在日化用品中的应用提供理论依据。1 材料与方法1.1试验材料HaCaT细胞株由中国科学院昆明细胞库提供;PP(C-036-171216)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1细胞培养HaCaT 细胞在 37、5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞融合度在 90%以上时传代,经0.5%胰蛋白酶消化后,使用高糖 DMEM 培养基分别以对应的细胞密度将细胞接种于 60 和 90mm培养皿或 96 孔细胞培养板中。1.2.2HaCaT 细胞紫外损伤模型的建立将 HaCaT 细胞接种于 60mm 细胞培养皿
11、中,待细胞融合 80%时,将 1 根 20W 的 UVB 灯管悬于超净台内对细胞进行照射,辐射剂量参照622云南农业大学学报第38卷XU 等7的研究结果,以 HaCaT 细胞刚发生增殖抑制的剂量进行后续试验,即 UVB 辐照剂量为21.6mJ/cm2。1.2.3无毒性 PP的浓度筛选通过四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltet-razolium,MTT)法检测 PP对于细胞生长的毒性作用,进行浓度筛选,以用于后续试验。按1.2.1 节所述方法将 HaCaT 细胞接种于 96 孔培养板中,当细胞融合 80%时,换成含有不同浓度PP(0、0.125、0.250、0.500 和 1.00
12、0mol/L)的培养液。PP处理细胞 24h 后,每孔加入 20L5mg/mLMTT 溶液。避光于 37 培养箱中孵育4h,吸除上清,每孔加入 200LDMSO 溶液,室温振荡 10min,采用酶标仪于 492nm 处读板。1.2.4PP对紫外线损伤 HaCaT 细胞增殖的影响以及细胞形态观察通过结晶紫染色法研究不同浓度 PP对紫外线损伤 HaCaT 细胞增殖的影响。以 70 万/皿的细胞密度将 HaCaT 细胞接种至 60mm 细胞培养皿中过夜,待细胞贴壁牢固,用 PBS 清洗 12 次,将培养基换成含有 0.250 和 0.500mol/LPP的无血清培养基;继续培养 1h 后用 UVB
13、紫外灯管辐射细胞,然后放进细胞培养箱中培养;24h 后缓慢吸除培养基,用 PBS 清洗 23 次,使用4%多聚甲醛固定 20min;固定结束后用去离子水清洗 1 次,用 0.1%结晶紫染液染色 1min,用超纯水小心清洗 35 次后拍照记录。将细胞置于光学显微镜下,对细胞形态进行观察和拍照记录。1.2.5蛋白表达检测采用蛋白质免疫印迹法(Western-blot,WB)检测凋亡蛋白多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(polyADP-ribose polymerase,PARP1)、cleaved-PAR-P1、乙酰基-赖氨酸、SOD2(K68)和 SIRT3 蛋白的表达。采用 RIPA 高效裂解液裂解细
14、胞,经150000r/min 离心 15min 后取上清得到细胞总蛋白,采用 BCA 定量法测得蛋白浓度。取样品30g 进行上样,电泳转膜后将转移到膜上的蛋白质与一抗(-Tubulin)在 4 冰箱过夜孵育,第 2 天使用与一抗对应的二抗室温孵育 1h,在曝光机中成像并拍照。1.2.6数据分析所有数据均采用 GraphPadPrism5.0 软件进行作图和显著性分析。2 结果与分析2.1不同浓度 PP对 HaCaT细胞存活率的影响由图 1 可知:PP对HaCaT细胞具有一定的毒性。当PP浓度为0.125、0.250 和0.500mol/L时,对细胞增殖能力影响不大;当 PP浓度达到 1.000
15、mol/L 时,细胞存活率显著降低,PP表现出显著的细胞毒性(P0.001)。考虑到给药浓度小于 1.000mol/L时,PP对细胞增殖能力没有显著影响,故选择 0.250 和 0.500mol/L 作为后续试验的浓度。2.2PP对紫外损伤 HaCaT 细胞增殖的影响由图 2 可知:与空白对照组相比,UVB 照射可显著抑制 HaCaT 增殖,使之无法形成明显的细胞群落;而 PP的加入则可以缓解由 UVB 照射引起的细胞增殖抑制,且这种缓解作用随着PP浓度的增加而增加。2.3PP对 UVB 诱导细胞凋亡的影响由图 3可知:UVB可以显著提高 HaCaT细胞cleaved-PARP1 蛋白的表达,
16、从而引起细胞凋亡;PP 的加入可显著降低其表达水平,且0.500mol/LPP的效果优于 0.250mol/LPP。此外,相较于空白对照组,UVB 处理可使细胞变圆、变亮,表示细胞正在死亡,而 PP处理组细胞虽然也有不同程度的损伤,但是相较于 UVB 处理组损伤明显减轻。000.1250.2500.5001.0002040细胞存活率/%survival rate of cellcPP I/(molL1)6080100120nsnsns*注:“*”“*”和“*”分别表示处理间在 0.05、0.01 和 0.001 水平上差异显著;ns.无显著差异;下同。Note:“*”“*”and“*”indi
17、catesignificantdifferencesunder0.05,0.01,and 0.001 level among treatments,respectively;ns.without significantdifferences;thesameasbelow.图 1 不同浓度 PP对 HaCaT 细胞存活率的影响Fig.1EffectsofdifferentconcentrationsofPPonthecellsurvivalrateofHaCaTcells第4期高梓琪,等:重楼皂苷对紫外损伤的人永生化角质形成细胞(HaCaT)的保护作用研究6232.4PP对 SIRT3 和 SO
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