温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响.pdf
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1、A生命科学版),2023,44(4):51-58.引文格式:胡振儒,赵司淼,周回迎,温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响J.扬州大学学报(农业与Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44 No.4扬州大学学报(农业与生命科学版)第44卷第4期DOI:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.007温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响胡振儒,赵司淼,周回迎,覃尧,冉旭华,闻晓波*(海南大学动物科技学院,海口57 0 2 2 8)
2、摘要:A型塞内卡病毒(SVA)作为猪水疱性传染病的病原体之一,日益影响我国生猪养殖业的发展。为探究温度和酸性环境对SVA复制的影响,以CHN/SVA/HB/2018SVA株作为研究材料,采用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、热点残基、相互作用力等进行分析。将SVA病毒液在不同温度(4、2 5、37)及不同pH值(4.0、5.8、6.6、7.2)缓冲液中进行孵育,利用TCID5o和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对SVA进行稳定性分析。结果表明:SVA衣壳蛋白在特定条件下具有不稳定性且衣壳蛋白耐热性不高,蛋白质间通过弱相互作用结合而形成病毒颗粒。通过SVA热稳定和酸稳定的试验验证随孵
3、育温度升高或pH值下降,SVA病毒颗粒稳定性显著下降。综上,SVA具有热不稳定性和酸不稳定性,为新型高效疫苗与热稳定保护剂的研发提供一定参考。关键词:A型塞内卡病毒;衣壳蛋白稳定性;热稳定;酸稳定中图分类号:S852.65文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 51-0 8Effect of temperature and acidic conditions on the replication of SenecaviruHU Zhenru,ZHAO Simiao,ZHOU Huiying,QIN Yao,RAN Xuhua,WEN Xiaobo(Sc
4、hool of Animal Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)ABSTRACT:Senecavirus A(SVA),as one of the pathogens of swine vesicular infectious diseases,is affecting the swineindustry in China.To explore the effects of temperature and acidic conditions on the replication of SVA,CHN/SVA
5、/HB/2018 SVA strain was examined in the study.Bioinformatics software was employed to analyze the physical and chemicalproperties hotspot residues,and interaction forces of capsid proteins of SVA.In addition,SVA was incubated at differenttemperatures(4,25,37)o r w i t h d i f f e r e n t p H (4.0,5.
6、8,6.6,7.2)b u f f e r s.T CID s o a n d RT-q PCR me t h o d s w e r eused for the stability analysis of SVA.The results showed that SVA capsid proteins were unstable under certain condi-tions with low heat resistance.The virus particles were formed by weak interaction between the proteins.The stabil
7、ity ofSVA virus particles decreased significantly with the increase of incubation temperature or the decrease of pH value.It issuggested that SVA has thermal instability and acid instability,which provides some reference for the research and devel-opment of new high-efficiency vaccines and heat-stab
8、le protective agents.KEY WORDS:Senecavirus A;capsid protein stability;thermostability;acid stabilityA型塞内卡病毒(SenecavirusA,SV A)作为猪水疱传染病病原体之一,2 0 14年以来陆续在北美、南美及亚洲报道了相关疫情1。2 0 15年我国广东省报道首例因SVA感染的病例2 ,随后在福建、山东、广西等14个省份相继出现SVA感染的报道,表明该病在我国逐渐呈现出区域流行趋势,需重点加强对SVA的免疫防治工作3。鉴于SVA感染引起的新发传染病在我国境内快速传播,研发SVA疫苗保证高效
9、接种才是防控传染病的关键4。然而无论是灭活疫苗、减毒活疫苗还是病毒颗粒样疫苗,疫苗效力与疫苗制剂中完整颗粒含量有关。完整的病毒颗粒受温度变化或pH值降低的影响,病毒颗粒不可逆的裂解为五聚体,既减弱疫苗的免疫原性,也降低疫苗的质量。因此,病毒颗粒稳定性是研发高收稿日期:2 0 2 3-0 2-14基金项目:海南省自然科学基金资助项目(32 0 RC461);海南省现代农业产业技术体系建设专项(HNARS2022-2-G05)作者简介:胡振儒(1997 一),男,贵州六盘水人,海南大学硕士研究生,主要从事动物病毒性传染病防控研究。*通信作者,闻晓波,海南大学教授、硕导,主要从事动物病毒性传染病防控
10、研究;E-mail:x i a o b o _w e n h a i n a n u.e d u.c n。52第44卷扬州大学学报(农业与生命科学版)效疫苗的一个关键性因素,有助于提高免疫效力,延长免疫持续时间5-6 。在小RNA病毒科中,如口蹄疫病毒7 、脊髓灰质炎病毒8 、肠道病毒9 等多数小RNA病毒均具有热与酸的不稳定性。研究10 表明同为小RNA病毒科的甲型肝炎病毒具有热与酸稳定性,甚至在高达8 0 环境中或pH值 2.0 的酸性溶液下仍能保持完整的病毒颗粒。所以仅从病毒分类上无法判断SVA在温度和酸性环境中是否具有稳定性。目前,已知SVA是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员I,属
11、于无包膜、单股正链RNA病毒,SVA基因组约7 30 0 bp,仅包含1个开放阅读框(ORF),编码1个多聚蛋白,经蛋白酶水解后加工形成结构蛋白与非结构蛋白。其中VP1、VP2、VP3、VP44个结构蛋白构成2 0 面体结构,具有两重轴、三重轴和五重轴12 。相关研究表明病毒颗粒的稳定性主要受衣壳蛋白的影响,衣壳蛋白上的静电相互作用及氢键与弱疏水相互作用等非共价相互作用网络在自身组装、结构完整性与稳定性方面起着关键性作用13。然而,衣壳蛋白仅有部分界面残基参与到组装过程中,蛋白质相互作用界面上的残基所形成的非共价相互作用结合能不均匀分布,导致这一部分热点残基贡献出大部分结合能的现象。在高温或酸
12、性环境影响下,使衣壳蛋白中的热点残基提供的静电相互作用力、氢键与盐桥等稳定因素受到影响,病毒颗粒进而发生构象变化、裂解丧失病毒感染性,从而影响免疫原性14。相关研究15 表明,FMDV衣壳亚基间氨基酸侧链对颗粒稳定性和病毒的功能影响较大。所以热点残基在病毒颗粒稳定性方面的显著贡献,对了解SVA的热稳定性与酸稳定性,以及后续热稳定机制研究具有重要意义。本研究使用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、衣壳蛋白间的热点残基与作用关系进行深入分析,推测病毒衣壳蛋白在热或酸性环境下具有不稳定性;通过在特定温度与酸性环境下孵育SVA病毒液,使用TCIDso检测SVA病毒滴度,使用RT-qPCR对SVA
13、RNA拷贝数进行定量,探究温度和酸性环境对SVA稳定性的影响,为后续SVA疫苗的研发提供基础数据。1材料与方法1.1SVA衣壳蛋白稳定性生物信息学分析1.1.1SVA衣壳结构五聚体亚基理化特性分析使用ProtParam或ProtScale服务器计算SVA衣壳蛋白(PDB:3CJI)的理化性质,包括亲水性指数(G RA VY)、脂肪族指数、稳定性指数等参数计算;使用ChimeraX1.4分析SVA衣壳蛋白的三维结构;使用I-Mutant3.0进行残基突变分析。具体方法参照文献16 。1.1.2热点残基与蛋白质相互作用残基分析通过3个热点残基预测在线服务器PredHS、PPC H EC K 与KF
14、C-2分析SVA衣壳蛋白热点残基。判定热点残基原则为SVA衣壳蛋白数据提交至上述3个热点残基分析网站,当被2 个网站同时识别才判定为热点残基。而后将SVA衣壳蛋白数据提交至蛋白质相互作用、表面和组装(jsPISA)网络服务器上,识别SVA衣壳蛋白间相互作用网络。具体方法参照文献17 。1.2SVA热稳定和酸稳定试验材料1.2.1细胞与病毒SVA与IBRS-2细胞由海南大学动物科技学院动物医学实验室保存1.2.2主要试剂与仪器胎牛血清(FBS)为美国Invigentech公司产品;TRIzolReagent、2 XSYBRG r e e n q PCRM i x 试剂为北京兰杰柯科技公司产品;R
15、andom hexamer、RNa s e-f r e e d d H,O、5XH i Sc r i p t I I Bu f f e r、d NT PMix、H i Sc r i p t I反转录酶、RNA酶抑制剂为南京诺唯赞生物科技公司产品。实时荧光定量PCR仪(型号qTOWER3)为德国Analytik公司产品。1.3SVA热稳定和酸稳定试验方法1.3.1细胞培养IBRS-2细胞使用DMEM培养基(含10%FBS、10 0 U mL-1青霉素、10 0 gmL-1链霉素)置于37、5%CO,培养箱中培养,后续用于病毒培养与组织细胞半数感染量(TCIDso)测定。A)53胡振儒等:温度和酸
16、性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响第4期1.3.2热稳定和酸稳定试验将SVA病毒液设为温度处理组与酸性环境处理组,,其中未处理SVA病毒液作为对照组。温度处理组孵育过程:分别在4孵育4、8、15d,2 5孵育2、4、8 d,37 孵育8、16、48 h。酸性环境处理组孵育过程:SVA病毒液分别在pH4.0、5.8 的柠檬酸盐缓冲溶液和pH6.6、7.2 的磷酸盐缓冲溶液中以1:9的比例孵育1h,后续用于TCIDso测定病毒滴度变化。1.3.3病毒滴度测定温度处理组、酸性环境处理组和对照组用DMEM培养基进行10 倍稀释,取10-110-10 共10 个稀释度分别接种于长满单层IBRS-2细胞的
17、96 孔培养板上,每个稀释度以每孔0.1mL接种8 孔,其中以DMEM培养基(含2%FBS、10 0 U mL-1青霉素、10 0 gmL-1链霉素)作为阴性对照、未稀释病毒液作为阳性对照。经37、5%CO,细胞培养箱孵育1h后,弃病毒液后用0.0 1molL-1PBS缓冲溶液(pH7.2)漂洗2 次,每孔加人0.1mLDMEM培养基(含2%FBS、10 0 U mL-1青霉素、10 0 gmL-1链霉素)。每天观察并记录细胞病变情况,按照Reed-Muench方法计算TCIDso18 ,同一样品进行3次独立的病毒滴度检测1.3.4引物设计与合成参考SVA/HB/2018毒株的VP1基因序列(
18、登录号为MN922286),设计1对特异性引物,上游引物序列为5-TGGACTGGACATCGTATA-3,下游引物序列为5-TTGCGTAGTAATTGAAGGT-3。1.3.5总RNA提取及cDNA获取将SVA分别经温度和酸性缓冲液孵育后,取10 0 L病毒液接种到6 孔细胞培养板上,经37、5%CO2细胞培养箱中孵育2 d,提取SVA感染细胞后总RNA。利用反转录酶等试剂将总RNA反转录成cDNA,具体操作参照文献19。1.3.6RT-qPCR检测及标准曲线的建立以SVAcDNA为模板进行RT-qPCR检测。PCR反应体系中,2 XSYBRGreenqPCRMix10L,上、下游引物各0
19、.6 L,c D NA 模板0.4L,加ddH,O至2 0 L。反应条件:955min;9510 s,52 30 s,共40 个循环。每个样品做2 个重复,同1个样品进行3次独立的荧光定量PCR检测。以本实验室构建的pcDNA3.1-VP1重组质粒为标准质粒,经10 倍稀释后,以拷贝数对数值为结果绘制标准曲线。病毒基因组拷贝数计算公式如下:拷贝数/copiesL-1=6.021014质粒浓度(n g L-1)/(质粒分子量十插入片段分子量)6 6 0 。检测标准质粒浓度为38 0.40 ngL-1,质粒分子量加上插人片段分子量为6 2 50 bp,则拷贝数初始值为5.5510 10copies
20、 L-11.4数据及统计学分析使用GraphPadPrism9.O软件进行统计学分析及作图,采用单因素方差分析(One-wayANOV处理不同时间点的SVARNA拷贝数,P0.5,说明蛋白质间稳定性得到极大提升。此外,将VP1中158 H突变为K时,DDG0,则增加衣壳蛋白间稳定性。2.1.2理化性质分析对SVA衣壳蛋白理化性质分析结果(表1)显示,SVA衣壳蛋白中VP1与VP4为碱性(PI7),VP2与VP3为酸性(PI 40,说明VP1并不稳定。此外,VP1一VP4中亲水性总平均值 0、芳香族占比 40,表明蛋白质不稳定;不稳定指数40thatindicatespro-tein insta
21、bility;Instability index4o that indicates protein stability.2.1.3SVA衣壳蛋白热点残基和相互作用预测分析衣壳蛋白间的热点残基有助于了解病毒衣壳蛋白的稳定性。本研究对SVA衣壳蛋白的热点残基进行了识别,结果(表2)显示,在VP1一VP4上分别检测到16、11、16 和5个热点残基。通过PISA蛋白相互作用分析,SVA衣壳蛋白的多数热点残基在界面处与相邻残基形成氢键,少数热点残基形成盐桥,且至少以1种相互作用力参与到衣壳界面上,但缺少二硫键与范德华力等相互作用力17.2 0 1。通过SVA衣壳蛋白间理化性质、热点残基及相互作用力的分
22、析,推测SVA在高温或酸性环境中具有热不稳定性或酸不稳定性。2.2热稳定性试验为验证SVA具有热不稳定性的推测,将SVA病毒液分别在4、2 5、37 条件下处理不同时间,检测病毒滴度的变化。对照组SVA病毒滴度为10 8.8 TCIDsomL-1,4处理4、8、15d,病毒滴度分别下降10 0.6 6、10 1.14、10 2.35TCIDsomL-1(图2.A)。2 5处理2、4、8 d,病毒滴度分别下降10 2.34、10 2.6 4103.56TCIDsomL-1(图2.B)。37 处理8、16、48 h,病毒滴度分别下降10.8 5、10 1.57、10 4.6 5TCIDsomL-1
23、55第4期胡振儒等:温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响(图2.C)。当SVA病毒液在不同温度下孵育时间延长时,SVA病毒滴度均有不同程度的下降,说明SVA对外界环境中的温度较敏感(P0.05)。表2 SVA热点残基与蛋白质网络Tab.2Detect hotspot residues and protein network of SVA capsid protein蛋白质界面衣壳蛋白残基(PredHS/PPCHECK/KFC-2)蛋白质网络interface of protein-proteinscapsid proteinresidues(PredHS/PPCHECK/KFC-2)ne
24、tworkof protein-proteinsVP1-VP2VP132Asn,112Ser252Leu.255Arg、2 57 T h r43个氢键,6 个盐桥VP2411le,44Leu,47Leu,166Thr、2 36 T y r43hydrogen bonds and6saltbridgesVP1-VP3VP16Glu、6 7 G ln、8 7 T h r、8 8 A r g、92 T y r、36个氢键,6 个盐桥190Val、195T r p.2 0 6 A r g、2 51M e t、2 45Ph e36hydrogenbondsand6saltbridgesVP3137Pro
25、、138 G l u、18 1T y r、18 2 T y r、18 9T r p、193Phe224Glu、2 32 T h rVP1-VP4VP1122Asp6个氢键,1个盐桥VP416Asn,32Ser6hydrogen bondsand1saltbridgesVP2-VP3VP253Leu,122Cys,209Pro、2 15Le u17个氢键,1个盐桥VP3128Gln、197 T y r、198 G l n、2 10 A r g、2 2 4G l u17hydrogen bondsand 1 salt bridgesVP2-VP4VP221Asp、2 4Pr o8个氢键VP465L
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