双三倍体银鲫超数微小染色体的基因组特征.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0017双三倍体银鲫超数微小染色体的基因组特征石 倩1#丁 苗2#汪 洋2,3 周 莉2,3 王忠卫2,3 张晓娟2 李 志2 李熙银2,3*桂建芳2,3*(1.大连海洋大学水产与生命学院,大连 116023;2.中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室,水产品种创制与高效养殖重点实验室,湖北洪山实验室,中国科学院种子创新研究院,武汉 430072;3.中国科学院大学,北京 100049)摘要:为了揭示双三倍体银鲫超数微小染色体基因组特征,利用银鲫超数微小染色体富集的卫星序列及染色体荧光原位杂交,鉴定了银鲫基因组数据库中超数微小染色体
2、序列,并对这些序列进行了基因组解析。研究发现在银鲫基因组数据库中存在15个scaffold为潜在超数微小染色体序列,这些序列中的22.28%与其祖先种双二倍体鲫的常规染色体存在同源性。双三倍体银鲫超数微小染色体重复序列含量明显高于双二倍体鲫和双三倍体银鲫的常规染色体,且重复序列组成也存在差异。随后,研究发现在银鲫中扩张的与减数分裂相关的8个基因家族,有6个在超数微小染色体序列上含有扩增拷贝,且这些扩增拷贝在银鲫卵子发生过程中具有转录活性。此外,根据超数微小染色体扩增拷贝的特异性序列开发了3个超数微小染色体特异的SCAR标记,可以用来区分双二倍体鲫和双三倍体银鲫。研究结果表明,双三倍体银鲫超数微
3、小染色体起源于常规染色体,演化过程中积累了大量重复序列和部分活性基因,且大多数减数分裂相关基因的扩张通过超数微小染色体完成。研究结果不仅解析了双三倍体银鲫超数微小染色体基因组特征,也为超数染色体在单性生殖演化中的作用提供了创新见解。关键词:单性生殖;超数微小染色体;重复序列;性染色体;减数分裂;银鲫中图分类号:Q344+.1 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)11-1816-11 超数染色体(又叫超数B染色体、B染色体或者额外染色体),是指除了常规染色体(又叫常规A染色体或A染色体:包含常染色体和性染色体)之外的非必须染色体1。超数染色体最早于1907年在半翅目昆虫中被记
4、载2,且预计存在于约15%的真核生物中3。由于超数染色体不遵循孟德尔遗传定律,所以其数量在同一群体不同个体之间也会存在差异4。超数染色体通常被认为起源于常规染色体,并且能够积累细胞器来源的DNA序列4。超数染色体发现之初,被认为不含有关键基因且没有功能,然而,随着测序技术和基因功能研究手段的迅速发展,越来越多的证据显示超数染色体上的活性基因能够发挥重要的生物学功能5,6,且为物种的演化提供了额外的基因组材料7,例如:在小麦病原真菌(Zymoseptoria tritici)中,超数染色体能增强其对小麦的致病性8;在黑麦(Secale cereale)中,超数染色体能够增加常规染色体的重组率并增
5、强其对逆境条件的适应性9,10;在玉米(Zea mays L.)中,超数染第 47 卷 第 11 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.11 2023 年 11 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAN o v.,2 0 2 3 收稿日期:2023-01-11;修订日期:2023-03-20基金项目:国家重点研发计划“农业生物种质资源挖掘与创新利用”(2021YFD1200804);中国科学院战略先导专项(XDA24030104);国家自然科学基金(32202923和31873036);国家现代农业产业技术体系(CARS-45-07);国家重点实验室自主课题(2019FB
6、Z04);中国科学院青年创新促进会(2020334);国家博士后科学基金会(2022M713322)资助 Supported by the National Key Researchand Development Project(2021YFD1200804);the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences(XDA24030104);the National Natural Science Foundation of China(32202923 and 31873036);China Agr
7、iculture ResearchSystem of MOF and MARA(CARS-45-07);the Autonomous Project of the State Key Laboratory of Freshwater Ecology andBiotechnology(2019FBZ04);the Youth Innovation Promotion Association CAS(2020334);China Postdoctoral ScienceFoundation(2022M713322)作者简介:石倩(1998),女,硕士研究生;主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail:
8、丁苗(1991),女,特别研究助理;主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail:#共同第一作者通信作者:李熙银,E-mail: 桂建芳,E-mail:*共同通信作者色体能够增强其对坏死病的抵抗能力11;在洞穴鱼(Astyanax mexicanus)中,超数染色体含有性别决定基因,具有雄性决定作用5。多倍体鲫复合种包括有性生殖四倍体鲫(Caras-sius auratus)和单性雌核生殖六倍体银鲫(Carassiusgibelio),广泛分布于亚欧大陆及邻近岛屿的淡水水系12,13。全基因组解析揭示四倍体鲫是双二倍体(AABB,n=100),包含两套二倍体基因组,每套二倍体基因组源于不同祖先;六倍
9、体银鲫是双三倍体(AAABBB,n150),包含两套三倍体基因组,每套三倍体基因组源自不同祖先1416。约8296万年前,双三倍体银鲫由祖先双二倍体鲫经同源三倍化而形成,多倍化后的双三倍体银鲫通过雌核生殖克服三个同源染色体不能正常配对和均等分离的生殖障碍14。雌核生殖是指母本产生不减数卵子,不减数的卵子在同域有性生殖物种精子的刺激下进行胚胎发育,最终产生与母本遗传背景一致的全雌子代17,18。双三倍体银鲫通过抑制减数第一次分裂,从而产生不减数的卵子14,并利用同水域的双二倍体鲫或其他物种的精子进行雌核生殖17,18。有意思的是,雌核生殖银鲫不同于其他单性脊椎动物,在自然群体中含有少部分雄性个体
10、19。双二倍体鲫含有100条常规染色体,不含有超数染色体;而双三倍体银鲫含有约150条染色体,除了常规染色体之外还有一些超数染色体,由于银鲫的超数染色体大小比常规染色体偏小,我们将其称为超数微小染色体。银鲫雌性个体含有约9个超数微小染色体,而雄性个体比雌性个体多出了额外的34个雄性特异超数微小染色体,且这些雄性特异的超数微小染色体具有遗传雄性决定作用20,21。随后,我们通过荧光显微切割、体外扩增和测序,对这些雄性特异超数微小染色体进行了解析,并筛选到具有雄性特异或者雄性偏向表达的基因片段20。然而,银鲫雌性中超数微小染色体的基因组特征及其在单性雌核生殖方式演化中的作用仍不清楚。在本研究中,我
11、们利用银鲫超数微小染色体富集的重复序列和染色体荧光原位杂交,鉴定了银鲫雌性基因组中的潜在超数微小染色体序列。我们发现银鲫超数微小染色体含有所有常染色体的同源序列、大量重复序列以及完整活性基因。此外,大部分银鲫中扩张的减数分裂相关基因家族在超数微小染色体上存在扩增拷贝。这些结果不仅解析了双三倍体银鲫的超数微小染色体基因组特征,也为超数染色体在单性生殖演化中的作用提供了创新见解。1 1 材料与方法 1.11.1 实验材料本实验所使用的双二倍体鲫(C.auratus)和双三倍体银鲫(C.gibelio)来自于国家水生生物种质资源库(National Aquatic Biological Resour
12、ce Center,NABRC),中国科学院水生生物研究所。1.21.2 中期染色体制备双三倍体银鲫和双二倍体鲫有丝分裂中期染色体的制备采用植物血球凝集素体内诱导肾细胞制片技术,具体参考朱华平等22描述的方法进行。1.31.3 染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hy-bridization,FISH)FISH实验参照丁苗等20描述的方法进行,但方法有略微改动。FISH探针为超数微小染色体探针20和酵母人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)质粒探针。BAC质粒的接种和提取参考彭金霞等23描述的方法进行。其中,BAC质粒探针
13、的制备按照DIG-Nick Translation Mix试剂盒(Roche公司)的说明书进行。染色体玻片于65放置3h后,移至70变性液(35 mL去离子甲酰胺,10 mL灭菌水和5 mL 2SSC)中变性3min。将玻片放入预冷的70%、90%和100%的乙醇中依次脱水5min,自然晾干玻片。与此同时,将探针混合液(50%去离子甲酰胺,20SSC,10%SDS,0.25 mg/mL 鲑精子DNA,50%硫酸葡聚糖,100 ng BAC质粒探针和5 ng超数微小染色体探针),于100的水中变性10min,而后将探针混合液立即置于冰上;将探针变性混合液孵育染色体玻片,37避光杂交24h。在杂交
14、完毕后,玻片放置于20%去离子甲酰胺(35 mL灭菌水,10 mL去离子甲酰胺和5 mL 20SSC)中洗10min。随后于2SSC(含1%Tween)中洗5min,之后放于1PBST中洗3次,每次5min;1PBS中洗3次,每次5min。接着于每张玻片中加200 L羊抗Dig稀释液(羊抗Dig1PBS=1100),37湿盒中避光孵育1h。然后将玻片于1PBS中洗3次,每次5min,自然晾干后,在每张玻片用150 L(2 g/mL)的DAPI染色,盖上盖玻片,37湿盒避光染色1h。最后将玻片放于1PBS中洗3次,每次5min,加30 L的抗淬灭剂封片,借助共聚焦显微镜镜检。1.41.4 DNA
15、提取和PCR剪取适量大小的尾鳍,用干净滤纸擦干鳍条表面黏液后,将样品放于1.5 mL的EP管中,然后加入500 L 核酸裂解液和10 L(10 mg/mL)蛋白酶K,放于55水浴锅中1h;待样品裂解充分后,14000 r/min离心5min,将上清液转入新的1.5 mL EP管中,加入11 期石 倩等:双三倍体银鲫超数微小染色体的基因组特征1817200 L 蛋白沉淀剂,上下颠倒混匀,置于冰上10min;待样品充分沉淀后,14000 r/min离心5min,吸取上清液于新的1.5 mL EP管中,加入500 L预冷的异丙醇,上下颠倒混匀(可见白色絮状物);14000 r/min离心5min,弃
16、上清,加入500 L 80%乙醇混匀;14000 r/min离心5min,弃上清,室温放置待白色沉淀变为透明物,加入100 L灭菌水,混匀以便充分溶解DNA。采用NanoDrop测浓度,将样品DNA浓度调为100 ng/L,调整好浓度的样品存于4待用。PCR模板为双三倍银鲫和双二倍体鲫基因组DNA,反应体系为20 L,包括10 L的Taq reactionMix,0.5 L的上下游引物,1 L的模板和8 L的灭菌水。扩增Cg-Ca-CL1、bmb-CgB、ccna2-CgB和nusap1-CgB,这些序列的引物在表 1中,PCR反应程序为:95 3min;95 15s,60 20s,72 20
17、s,35个循环;72 5min,12 5min。待PCR程序结束后,PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶检测,检测时采用的Marker为TaKaRa DL2000。1.51.5 共线性分析以已发表的银鲫基因组及基因组BAC序列为参考数据库,Cg-Ca-CL1为查询序列,借助 BLAST软件24,使用默认参数比对,获取超数微小染色体基因组序列,再将鉴定到的超数微小染色体序列分别和已发表的双三倍体银鲫常规A染色体序列(GenBank ID:PRJNA546443)及双二倍体鲫基因组(GenBank ID:PRJNA546444)通过Minimap225进行基因组共线性分析,结果借助Circos26展示
18、。1.61.6 重复序列注释和基因通路分析使用Repeatmask27软件进行重复序列分析。对超数染色体序列上的注释基因进行KEGG通路分析和GO通路分析(https:/david.ncifcrf.gov/)。1.71.7 荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitativePCR,qPCR)qPCR采用SYBR Green染料法根据操作说明进行基因表达量的检测。qPCR反应体系为20 L,包括10 L的 SYBR Mix,0.5 L的上下游引物(表 1),1 L的模板和8 L的灭菌水。反应程序为:95预变性,95 15s,60 20s,72 20s,40个循
19、环。每个反应进行3次重复,采用2Ct计算获得基因的相对表达量。2 2 结果 2.12.1 双三倍体银鲫超数微小染色体序列鉴定在前期研究中筛选到双三倍体银鲫中含量最高的重复序列Cg-Ca-CL1,利用该重复序列为探针,通过染色体FISH能够特异性标记银鲫的超数微小染色体20。双三倍体银鲫由祖先双二倍体鲫经同源三倍化而形成14,利用Cg-Ca-CL1探针在双二倍体鲫中进行染色体FISH分析,发现双二倍体鲫不含有超数微小染色体,且常染色体和性染色体上也没有明显荧光信号(图 1A)。由于Cg-Ca-CL1在双二倍体鲫中的含量低,通过FISH在双二倍体鲫中检测不到Cg-Ca-CL1信号,但是利用PCR扩
20、增及其产物序列测定,能够在双二倍体鲫中检测到Cg-Ca-CL1(图 1B)。在双二倍体鲫中,Cg-Ca-CL1扩增条带单一,说明该序列不是以串联重复形式存在;而在Cg-Ca-CL1在双三倍体银鲫中PCR扩增出不同长度条带,说明Cg-Ca-CL1发生了扩增且以串联重复的形式存在(图 1B)。这些结果揭示同源三倍化之后,Cg-Ca-CL1在双三倍体银鲫的超数微小染色体上发生了扩增和富集。因此,我们拟通过该重复序列并结合染色体荧光原位杂交来筛选双三倍体银鲫超数微小染色体序列。对双三倍体银鲫雌性基因组(GenBank:PRJNA546443)进行了重复序列Cg-Ca-CL1搜寻,总共发现18个未组装的
21、scaffold和12个组装好的染色体含有该重复序列,包含Cg-Ca-CL1的拷贝数从5到3157不等(图 1C)。这18个scaffold由于未能组装到染色体,可能是潜在超数微小染色体序列。随后,在这尾测序个体构建的酵母人工染色体文库中,筛选到500个 BAC质粒含有Cg-Ca-CL1。拿这些BAC质粒序列与上述的18个scaffold进行序列比对,最终鉴定表 1 引物序列Tab.1 Primer sequences引物Primers序列Sequence(53)Cg-Ca-CL1-FGCAATGTAACTTTTCATGCCg-Ca-CL1-RCACTAGAAATATGCTATTCTCACin
22、cenp-Cg(B+chr3B)-F CTCGTCACGCCACACGTGCCAACAincenp-Cg(B+chr3B)-R CCAGAGAACGGCGTACCACCAfbxo5-Cg(B+chr18B)-F ATAACGGGGACGTGGATGCTGTfbxo5-Cg(B+chr18B)-R TATCAACGACGGTCCAGTCGTAAlap2-Cg(B+chr9A)-FCCGAAAAGGAAGAGAAAGCAGlap2-Cg(B+chr9A)-RTGTGCTGTGAGGCCTGTGTTAbmb-CgB-FGGAAGGACAGGAGCAGCTGGACAbmb-CgB-RCGGACCACA
23、GCCAGGTCCTccna2-CgB-FTGCATAATCTGAGACTTCATTGCccna2-CgB-RGTTTTGGAGAGAAATCCTCCATnusap1-CgB-FCCTCCTCTTGGATCCCCTTTGAnusap1-CgB-RGGTTACAGTGTGCGCGCCCTGC-actin-FAGCACGGTATTGTGACTAACTG-actin-RTCGAACATGATCTGTGTCATC1818水 生 生 物 学 报47 卷出85个BAC质粒序列能比对上其中的15个scaffold(序列相似度大于95%)。在15个scaffold中,分别选择一个能匹配的BAC质粒为探针(表
24、2),通过FISH进行染色体定位分析。FISH结果显示,这15个BAC质粒的信号均位于超数微小染色体上,而在常规染色体上没有明显信号,因此,可以推测这些BAC质粒所对应的scaffold序列是超数微小染色体序列(图 2)。2.22.2 超数微小染色体含有常规染色体同源序列由于双三倍体银鲫由祖先双二倍体鲫经同源三倍化而形成14,同时选取了双三倍体银鲫及双二倍体鲫为对照,通过序列比对来揭示双三倍体银鲫超数微小染色体的序列特征。双三倍体银鲫中未组装的序列不能确定是常规染色体还是超数微小染色体序列,所以我们舍弃了这部分未组装的序列,只用组装到染色体的50条常规染色体序列来做超数微小染色体同源性分析。双
25、二倍体鲫中由于不含有超数微小染色体(图 1A),其未组装的序列都是来源于常规染色体,所以双二倍体鲫所有序列都用来做超数微小染色体同源性分析。我们发现银鲫5.48%的超数微小染色体序列与银鲫组装的常规染色体具有同源性,且同源序列在每个常规染色体上都有分布,其中含有超数微小染色体同源序列最多的常规染色体依次是chr1B、chr4A和chr16A(图 3A)。同时,与双二倍体鲫基因组进行比对时发现,22.28%的超数微小染色体序列在双二倍体鲫基因组中能找到同源序列,其中含有超数微小染色体同源序列最多的是未组装的序列及chr25B、chr21B和chr22B号染色体(图 3B)。由于双三倍体银鲫中部分
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