免疫组织化学切片行EBER原位杂交检测方法的建立及应用.pdf
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7、695.2023.15.025免疫组织化学切片行EBER原位杂交检测方法的建立及应用滕孝静程鸣周贺王照情陈光勇”(首都医科大学附属北京友谊医院病理科北京10 0 0 50)【摘要】目的在石蜡组织免疫组织化学(IHC)阴性切片上建立EBER原位杂交(ISH)检测方法,为EB病毒相关淋巴组织病变在组织资源不足的情况下提供及时有效的检测结果及诊断依据。方法回顾性收集首都医科大学附属北京友谊医院病理科2 0 2 1年1月至2 0 2 3年2 月间EBER原位杂交检测阳性的病例2 3例,其中NK/T细胞淋巴瘤8 例,弥漫大B细胞淋巴瘤6 例,伯基特淋巴瘤2 例,经典霍奇金淋巴瘤4例,传染性单核细胞增多症
8、3例。先选取1例组织量充足的EB病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤组织用于IHC后EBERISH前组织预处理条件的摸索,然后使用最佳预处理条件建立本实验的检测流程并用于另外2 2 例组织中。2 2 个蜡块每例连续切片2 张,1张进行常规的EBER原位杂交检测,归为对照组;另1张归为实验组,先进行IHC染色,再按最佳预处理条件进行EBER原位杂交。最后对两组切片杂交的成功率、阳性强度、阳性细胞比例及组织细胞结构进行观察对比。结果实验组EBER杂交的成功率为9 0.9 1%(2 0/2 2),与对照组10 0%(2 2/2 2)相比,差异无统计学意义(P0.05),杂交成功的切片阳性着色位于细胞核,定位准
9、确,背景干净。两组切片的阳性细胞比例差异无统计学意义(P0.05)。染色强度上,对照组中8 例评分为3分的组织在实验组评分为2 分,使两组染色强度的对比差异有统计学意义(P 0.0 5).T h e r ewas no statistically significant difference in the proportion of positive cells between the two groups(P 0.05).In terms of staining intensity,8tissues scored 3 points in the control group were scor
10、ed 2 points in the experimental group,which made a statistically significant difference in thecomparison of staining intensity between the two groups(P 0.05),but the hybridization results of 8 tissues could stil be clearly interpreted.Inboth the experimental group and the control group,there were no
11、 dissections and incomplete cell morphology and structure.Conclusion The IHC-EBER in situ hybridization method has simple operation,accurate positioning,high success rate and accurate results,which can effectively solvethe problem that patients cannot perform EBER in situ hybridization detection due
12、 to insufficient section or tissue resources,and can provide a timelyand effective diagnostic basis for EBV-related lymphoid tissue diseases,which has clinical practical value and is worth promoting.Key Wwords】In s i t u h y b r i d i z a t i o n;EB v i r u s;R NA;Immu n o h i s t o c h e mi s t r y
13、;Ly mp h o maEB病毒是一种嗜人类淋巴细胞的线形双链DNA病毒,可感染全世界9 0%以上的人群1。其与伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)、NK/T 细胞淋巴瘤(NK/Tcell lymphoma,NK T CL)、经典霍奇金淋巴瘤(classicHodgkinslymphoma,c H L)、弥漫大B细胞淋巴瘤(dif-fuse large B cell lymphoma,DLBCL)等多种肿瘤的发生、发展、治疗及预后有密切关系2 ,是最早被确定的人类肿瘤病毒3。目前临床常用的EB病毒检测方法包括:外周血EB病毒-DNA定量检测、外周血EB病毒抗体检测、免疫组织
14、化学(immunohistochemistry,I H C)检测和EB病毒编码的小RNA(EB v ir u s e n c o d e d s m a ll R NA,EBER)原位杂交(in situ hybridization,ISH)等方法4-6 ,其中EBERISH因其敏感性高、特异性强、定位精准等原因成为活检组织中诊断EB病毒感染的金标准7 ,可为肿瘤筛查、诊断、治疗、及预后判断提供可靠的病理学依据。在临床工作中,一般EBER ISH在苏木精伊红染色和多项IHC染色之后进行,而此时一些小活检组织(如淋巴结穿刺、骨髓穿刺等)时常会遇到肿瘤细胞剩余不足无法制片的棘手问题,或者会诊患者带
15、来的切片在前期IHC检测中已经用完,没有剩余切片进行EBERISH 的难题。面对已有的多张IHC 切片,本研究尝试在IHC染色阴性的切片上建立EBERISH的检测方法,旨在为组织资源不足的EB病毒相关淋巴组织病变提供及时有效的检测结果及病理诊断依据。1材料与方法1.1组织来源回顾性收集2 0 2 1年1月至2 0 2 3年2月间首都医科大学附属北京友谊医院病理科常规外检及会诊的EB病毒相关淋巴组织疾病2 3例,其中本院14例,外院会诊9 例,具体病理组织来源及类型见表1。所有标本均为甲醛溶液固定石蜡包埋组织,且初诊EBER ISH 均为阳性。表12 3例EB病毒相关淋巴组织疾病的病理组织来源及
16、类型例数(n=23)手术切除标粗针穿刺标骨髓环钻标诊断本院外院本(n=11)本(n=10)本(n=2)NKTCL0DLBCL51BL2cHL4传染性单核细胞增多症3:1661 1.2试剂及仪器IHC 一抗(CD10、CD 2 0、CD 30)及二抗均购于福州迈新公司,CD10、CD 2 0、CD 30 单克隆鼠抗的克隆号分别为MX002、L2 6、Be r H 2;二抗及放大系统使用EliVision检测试剂盒,染色采用迈新全自动IHC染色仪(型号:LabVisionAutostainer720);EBER 探针和免疫显色机染试剂购于徕卡生物系统有限公司,EBERISH检测使用徕卡BOND-I
17、II 染色机。1.3方法1.3.1IHC检测将切好的玻片置于6 0 的烤箱中烤片1h,打印标签贴于玻片上,将切片插人切片夹装入染色机中,再将一抗、二抗、3.3-二氨基联苯胺(3.3-Diaminobenzidine,DAB)、苏木精等试剂瓶放人染色机试剂区准备运行。切片脱蜡后在pH9.0的抗原修复液中99加热2 0 min,然后依次经过氧化氢溶液、一抗、放大剂、二抗孵育10、30、10、10 min,DAB显色5min,苏木精复染后封片。1.3.2常规EBER原位杂交使用染色机按EBER探针和免疫显色机染试剂盒中推荐的步骤进行EBERISH。主要染色步骤为:二甲苯脱蜡,过氧化氢阻断内源性过氧化
18、物酶10 min,蛋白酶K消化7 min,EBER探针杂交2 h,一抗、一抗后试剂、二抗依次孵育15、8、10min,DAB显色2 min,苏木精复染后封片。1.3.3预实验IHC后EBERISH前,组织的预处理对杂交结果至关重要,所以本文首先选取1例组织量充足的DLBCL手术切除标本进行预实验。实验前先观察该病例初诊时所有IHC抗体的着色情况,选出阴性表达的抗体为CD10,然后将蜡块连续切片5张,分成5组。1张在BOND-III染色机上进行本实验室常规的EBERISH程序,归为PC组;另外4张切片先进行CD10IHC染色,显微镜下观察抗体着色情况(阴性)后,次日揭掉盖玻片,将玻片放人干净的二
19、甲苯中脱胶2 0 min,然后放入BOND-II染色机上,依据使用的预处理方法不同:BONDEpitope Retrival Solution 2(ER2液)10 0 修8350200013104220000复10 min、ER 2 液10 0 2 0 min、ER 2 液10 0 30 min、蛋白酶K消化7 min,将切片分别归为 P1组、P2组、P3组和 P4组,4 组切片后续杂交步骤与 PC 组相同。最后根据杂交结果选择P2组的预处理条件为最佳条件。:1662:1.3.4免疫组织化学阴性切片行EBER ISH(I H C-EBER ISH)检测对另 2 2 个病例的初诊IHC 切片进行
20、复阅,确定出NKTCL、BL、D LBCL、c H L、单核细胞增多症5 种诊断病例中 IHC 阴性表达的抗体分别为 CD20、CD30、C D 10、C D 10、C D 10,以备后续IHC染色。然后将22个病例每例连续切片两张,1张进行常规的EBERISH检测,归为对照组;另1张归为实验组,先进行IHC染色,之后在普通光学显微镜下对IHC结果进行观察确认。次日将玻片在捞烤机上烘烤10 min,轻轻揭掉盖玻片后放人二甲苯中脱胶2 0 min,然后将玻片插人BOND-II染色机上,选择ER2液10 0 2 0 min的预处理条件进行EBERISH。最后对两组切片杂交后的成功率、阳性强度、阳性
21、细胞数目及组织细胞结构进行观察对比。1.4结果判读所有染色切片均由本院病理科1名主治医师和1名副主任医师进行判读。EBER ISH 阳性的判读标准为:细胞核内出现均匀一致的淡黄棕黑色着色,细胞膜和细胞浆(核分裂时除外)无着色。采用半定量评分法8 对EBERISH染色强度和阳性细胞比例进行评估。强度评分如下:(1)阴性():细胞核未见着色,0;(2)弱阳性(+),细胞核呈淡黄色,1分;(3)中等阳性(2+),细胞核呈橘黄或棕黄色,2 分;(4)强阳性(3+),细胞核呈棕褐色或棕黑色,3分。显微镜下每张切片随机选取5个高倍视野(40 0),计数每个视野阳性细胞数和细胞总数。阳性细胞比例(阳性细胞数
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