基于网络药理学和实验验证探讨加味孔圣枕中丹治疗痴呆的分子机制.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目();山东省自然科学基金面上项目()作者简介:宋爱珍(),女,硕士研究生在读,研究方向:方剂作用机制及药效物质基础研究,:通信作者:于华芸(),女,博士,教授,博士研究生导师,研究方向:方剂作用机制及药效物质基础研究,:基于网络药理学和实验验证探讨加味孔圣枕中丹治疗痴呆的分子机制宋爱珍周杨尚春光吴智春,于华芸,(山东中医药大学中医学院,济南,;山东省中医经典名方协同创新中心,济南,)摘要目的:基于网络药理学和分子对接技术研究加味孔圣枕中丹()治疗痴呆的作用机制。方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台()、中医药百科全书数据库()筛选 活性成分及靶点;利用 、数据
2、库以及治疗靶点数据库()筛选痴呆靶点。活性成分作用靶点和疾病靶点交集获得 治疗痴呆的潜在作用靶点,数据库进行潜在作用靶点的基因本体()富集分析和京都基因与基因组百科全书()通路归类分析。软件构建 中药 活性成分 潜在作用靶点 通路网络。软件进行分子对接验证实验。体内复制大鼠血管性痴呆()模型,灌胃给药干预 ,水迷宫实验评价其记忆力,免疫组织化学法检测大脑皮质脑源性神经营养因子()表达水平。结果:筛选获得 活性成分 个,对应痴呆潜在作用靶点 个,主要涉及血液循环、血管直径调节、化学突触传递调控等生物过程;铵离子结合、儿茶酚胺结合、神经递质结合等分子功能以及膜微区等细胞组分。通路分析显示,可能通过
3、神经活性配体 受体相互作用、间隙连接、血管内皮生长因子()信号通路、活化蛋白激酶()信号通路等发挥抗痴呆作用。分子对接结果显示,活性成分槲皮素、熊果酸、丹参酮等分别与其对应的潜在作用靶点白蛋白()、白细胞介素 ()、等具有较好的结合力和稳定性。体内实验结果表明,可延长 大鼠象限内游泳时间,提高大脑皮质 表达水平。结论:通过神经活性配体 受体相互作用、等信号通路发挥调节胆碱能系统、抑制凋亡、改善神经炎症、血管新生等作用,这可能是 治疗痴呆的作用机制。关键词加味孔圣枕中丹;痴呆;网络药理学;分子对接;体内实验;信号通路;信号通路 ,(,;,):():()(),(),()()(),():(,),(,
4、),(),(),(),(),(),:,;中图分类号:文献标识码:痴呆是一种以认知损害为特征的临床综合征,其损害程度足以影响患者的日常生活和社会交往,我国痴呆患病率为 ,高于 的全球平均水平 ,且随着我国人口老龄化的不断加深,其患病率逐年增高,给家庭和社会带来沉重负担。中医药在痴呆的预防和治疗中具有明显优势 。肾虚髓亏、痰瘀阻窍是痴呆常见的病因病机,临证治疗从益精填髓、化痰祛瘀着手,多有佳效 。加 味 孔 圣 枕 中 丹(,)是 备急千金要方 孔圣枕中丹加减化裁的方剂,临证治疗肾虚痰瘀阻窍型痴呆具有一定疗效 。实验研究亦发现本方能够改善多种痴呆动物模型的学习记忆力 ,但其具体分子机制有待进一步明
5、确。网络药理学基于“中药 成分靶点 通路 疾病”互作网络,能系统、整体地分析中药以及有效成分与疾病、靶点、通路之间的关系,与中药复方多成分、多靶点、多通路协同作用特点相符合,可为中药复方药效物质基础和分子作用机制研究提供一定参考 。本研究基于网络药理学策略,结合分子对接技术,从多成分、多靶点、多通路角度分析 治疗痴呆的可能药效物质基础和潜在作用靶点,探讨其作用机制,为本方临床与实验研究提供思路和依据。材料与方法 材料 动物取无特定病原体(,)级雄性 大鼠 只,周龄,体质量 ,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供 动物许可证号:(京)。大鼠饲养于 独立送回风净化笼,恒温 ,恒湿 ,光照明暗交替
6、 ,实验前适应性饲养,自由摄食、摄水。实验动物及操作均符合山东中医药大学医学实验动物中心伦理委员会原则(伦理审批号:)。药物 由山东中医药大学附属医院药剂科煎制,每毫升含龟甲 、生龙骨 、山茱萸 、肉苁蓉 、石菖蒲 、远志 、丹参 、川芎 。试剂与仪器脑源性神经营养因子(,)小鼠单克隆抗体(公司,美国,货号:),浓缩型 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:),超薄切片机(徕卡微系统有限公司,德国,型号:),石蜡切片机(徕卡微系统有限公司,德国,型号:),光学显微镜(公司,日本,型号:)。方法 组成中药潜在活性成分筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台(,),口服生物利用度(,),类 药
7、 性(,);中医药百科全书数据库(,),。同时结合文献研究筛选 组成中龟甲、龙骨、石菖蒲、丹参、山茱萸、川芎、肉苁蓉、远志的潜在活性成分 。治疗痴呆的潜在作用靶点筛选利用 、数据库筛选 各组成中药活性成分作用靶点。以“”“”为关键词,应用 数据库、治疗靶点数据库(,)、数据库筛选痴呆相关疾病靶点。将 组成中药活性成分作用靶点和痴呆相关疾病靶点信息分别输入 数据库,限定物种为“人类”,对靶点基因名进行标准化处理,韦恩法取其二者交集获得 治疗痴呆的潜在作用靶点。靶点之间的蛋白质 蛋白质相互作用(世界中医药 年 月第 卷第 期 ,)网络构建将 治疗痴呆潜在作用靶点导入 数据库,限定物种为“人类”,获
8、取靶点 网络信息,将节点和结合率分值等信息导入 软件,构建靶点之间的 网络。其中节点代表各作用靶点,每条边代表靶点之间的相互作用关系。“中药 活性成分 潜在作用靶点”网络构建将 的组成中药、潜在活性成分以及治疗痴呆潜在作用靶点导入 软件,构建“中药 活性成分 潜在作用靶点”网络模型,应用 插件分析其拓扑参数。治疗痴呆潜在作用靶点的 和 分析将 治疗痴呆潜在作用靶点导入 数据库,设定物种为“人类”,从生物过程(,)、分 子 功 能(,)和细胞组分(,)个方面进行基因本体(,)富集分析;同时对潜在作用靶点的京都基因与基因组百科全书(,)信号通路注释分析。分子对接实验利用分子对接技术进一步验证 治疗
9、痴呆的可能性。选取对应靶点数目最多的 个潜在活性成分作为对接的候选成分,选取 网络中 值较高的 个靶点作为候选靶点。利用 数据库下载成分化合物的 结构,数据库下载候选靶点的 结构,软件对靶点蛋白进行去水加氢处理,预测成分 靶点的结合,获得对接的结合能和氢键数,以评价成分与靶点蛋白的结合力和稳定性。结合能 ()为结合良好标准。分组与模型制备 只 大鼠随机分为假手术组、模型组和 组,每组 只。实验采用双侧颈总动脉结扎()建立血管性痴呆(,)大鼠模型 。大鼠按 水合氯醛以 进行腹腔注射麻醉,沿颈部中线切开,分离双侧颈总动脉,无菌丝线双结扎,剪断颈总动脉。假手术组仅分离双侧颈总动脉。逐层缝合伤口,外敷
10、少许青霉素钠。干预方法模型制备 后给药干预,组灌胃给予 水煎浓缩液 ,模型组和假手术组给予等体积生理盐水灌胃,次 ,连续给药 。检测指标与方法 水迷宫实验 水迷宫装置参照文献 选用大鼠通用型圆桶,按方位将水面和水桶分成 个象限。实验时,将高度为 ,直径为 的平台设置于东北象限,将大鼠先由远离平台的西南象限入水,然后分别由其他 个象限入水,至其找到平台,并在台上停留 。如果 未能找到,则将大鼠放在平台上 。实验历时 ,每天固定时间段训练 次。第 天,撤去平台,将大鼠由任一入水点放入水中,记录其在 内的游泳轨迹,分析各组大鼠穿越平台象限的次数和平台象限内的游泳时间。免疫组织化学法检测大脑皮质 表达
11、 多聚甲醛灌注取脑,石蜡包埋制片,常规脱蜡及抗原修复,按试剂盒说明书逐步进行免疫组织化学染色,用 法。蛋白主要在胞浆和细胞膜表达,阳性细胞可见棕黄色或棕褐色颗粒,采用 医学图像分析系统进行图像分析,倍镜下,随机取 个视野,测出 阳性反应细胞的积分光密度。统计学方法采用 统计软件进行数据分析,计量资料以均数 标准差(珋 )表示,组间比较采用单因素方差分析,以 为差异有统计学意义。结果 组成中药化学成分筛选获得 组成 味中药的潜在活性成分 个,其中丹参 个、石菖蒲 个、山茱萸 个、川芎 个、肉苁蓉 个、远志 个、龟甲 个、龙骨 个,共有成分 个(川芎和远志 个,丹参和山茱萸 个,山茱萸和川芎 个,
12、山茱萸和肉苁蓉 个,山茱萸和石菖蒲 个,丹参、山茱萸和川芎 个)。治疗痴呆潜在作用靶点筛选及 网络分析利用 、数据库预测筛选获得 组成中药成分作用靶点 个。利用 ,、数据库筛选获得痴呆相关疾病靶点 个。韦恩法进行靶点交集获得 治疗痴呆的潜在作用靶点 个。见图 。数据库构建 治疗痴呆的潜在作用靶点 网络,软件进行可视化分析。网络图含有 个节点,条边,平均节点度值为 ,靶点之间联系密切,关系错综复杂。见图 。治疗痴呆部分潜在作用靶点(按节点度值大小排列前 位)信息见表 。,表 治疗痴呆的部分潜在作用靶点信息序号靶点基因蛋白度值序号靶点基因蛋白度值 白蛋白 过氧化物酶体增生激活受体 丝氨酸 苏氨酸激
13、酶 乙酰胆碱酯酶 白细胞介素 细胞间黏附分子 脑源性神经营养因子 纤溶酶原激活物抑制剂 趋化因子配体 糖皮质激素受体 肿瘤蛋白 羟色胺转运体 内皮型一氧化氮合酶 儿茶酚胺氧位甲基酶 白细胞介素 血管内皮细胞黏附分子 前列腺素内过氧化物合酶 多巴胺 受体 表皮生长因子 集落刺激因子 趋化因子配体 分泌性磷蛋白 反应蛋白 诱导型一氧化氮合酶 趋化因子 配体 转化生长因子 雌激素受体 图 治疗痴呆靶点韦恩图图 治疗痴呆的潜在作用靶点 网络 中药 活性成分 靶点网络模型拓扑分析根据“中药 活性成分 潜在作用靶点”网络,删除没有对应疾病靶点的 个潜在活性成分,最终获得 个有疾病靶点的活性成分。网络共涉及
14、 个节点(个方剂节点、个中药节点、个活性成分节点、个靶点节点)和 条边。插件分析网络模型的拓扑参数,其中,网络平均连接度()为 ,网络中心度()为 ,网络异质性()为 ,网络密度()为 ,其主要活性成分槲皮素()、谷甾醇()、熊果酸()、山柰酚()、丹参酮()、隐丹参酮()、丹参新酮()、丹酚酸()、月桂酸()等,分别或共同作用于 、等靶点发挥作用。见图 。涉及的 个活性成分主要为醌类(个,如丹参酮、丹参隐酮等)、萜类(个,如熊果酸、鼠尾草酚酮等)、黄酮类(个,如木犀草素、山柰酚等)、脂肪酸类(个,如硬脂酸、肉豆蔻酸等)及其他氨基酸类、甾体类、生物碱等化合物 个。部分成分见表 。治疗痴呆潜在作
15、用靶点的 富集分析 富集分析共获得 条目 条(),按 值高低排列 条目,涉及血液循环()、血管直径调控()、化学突触传递调控()等 条;涉及铵离子结合()、儿茶酚胺结合()、肾上腺素结合()等 条;涉及膜筏()、脂膜筏()等 条,分别占 总条目的 、和 。见图(前 位)。世界中医药 年 月第 卷第 期图 中药 活性成分 靶点网络表 组成中药部分活性成分信息编号化合物中文名称来源中药类型,二羟基 ,二甲氧基黄酮川芎、远志黄酮,二羟基 ,三甲氧基黄酮川芎、远志黄酮 熊果酸丹参、山茱萸萜 齐墩果酸丹参、山茱萸萜 亚油酸乙酯山茱萸、川芎脂肪酸 谷甾醇山茱萸、肉苁蓉甾体 肉豆蔻酸山茱萸、石菖蒲脂肪酸 硬
16、脂酸丹参、山茱萸、川芎脂肪酸 川芎哚川芎生物碱 ()富马酸川芎脂肪酸 川芎萘呋内酯川芎挥发油 杨梅酮川芎黄酮 异前胡醚丹参香豆素 双没食子酸丹参鞣质 木犀草素丹参黄酮 丹酚酸丹参酚酸 ()丹参醇 ()丹参萜 香紫苏醇丹参萜 ()鼠尾草酚酮()丹参萜 去氢丹参酮丹参醌 (、)紫丹参甲素 (、)丹参醌 亚甲基丹参醌丹参醌 ()丹参酮()丹参醌 隐丹参酮丹参醌 异隐丹参酮丹参醌 异丹参酮丹参醌 ()新隐丹参酮()丹参醌 丹参新酮丹参醌 丹参二醇 丹参醌 苏齐内酯肉苁蓉木质素 ,续表 组成中药部分活性成分信息编号化合物中文名称来源中药类型 鹅掌楸树脂酚 二甲醚肉苁蓉木质素 槲皮素肉苁蓉黄酮 杨梅酮肉苁
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