发酵优化绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO高产吩嗪-1-羧酸.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.020发酵优化绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO高产吩嗪-1-羧酸刘桢桢,王 威,黄显清,张雪洪(上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室,上海 201100)摘 要 对绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO 的发酵条件进行优化并在 5 L 反应器中进行放大培养。在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计实验,优化得到最佳培养基组成为甘油 49.55 g/L、大豆蛋白胨 37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO4 0.75 g/L、K2HPO4 0.225 g/L,发酵
2、 60 h 后吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的最大产量为(6.010.17)g/L,是优化前的 2.6 倍。在 1 L 反应器中优化发酵 pH,当培养过程 pH 值维持在 6.8 时,PCA 的产量最高,为(7.160.04)g/L,是优化前的 1.2 倍。在最优培养基和 pH 条件下,对菌株在 5 L反应器中进行放大培养,发酵 60 h 后 PCA 的最大产量为(6.840.53)g/L。研究为提高 PCA 的生物合成速率和工业化应用提供支持。关键词 绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO;吩嗪-1-羧酸;发酵优化;中心组合设计;反应器中图分
3、类号 Q93文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0020-07Enhancement of phenazine-1-carboxylic acid production for Pseudomonas chlororaphis GP72-ND3phzO by fermentation optimizationLIU Zhenzhen,WANG Wei,HUANG Xianqing,ZHANG Xuehong State Key Laboratory of Microbial Metabolism School of Life Sciences and Biotechno
4、logy Shanghai Jiao Tong University Shanghai 201100 China Abstract The fermentation conditions of this strain were optimized and scaled up in a 5 L bioreactor.First through single factor ex-periment orthogonal experiment steepest climbing experiment and central composite design experiment at the shak
5、e flask level the optimal medium composition was obtained as 49.55 g/L glycerol 37.34 g/L soy peptone 1.5 g/L KCl 0.75 g/L MgSO4 and 0.225 g/L K2HPO4 and the maximum production of phenazine-1-carboxylic acid PCA after 60 h fermentation was 6.010.17 g/L which was 2.6 times as that before optimization
6、.Then the fermentation pH was optimized in 1 L bioreactors.When the pH was main-tained at 6.8 during the culture process the PCA production was the highest at 7.160.04 g/L which was 1.2 times as that before optimization.Finally under the optimal medium and pH conditions the strain was scaled up cult
7、ured in 5 L bioreactors and the max-imum PCA production after 60 h of fermentation was 6.840.53 g/L.This study provided support for improving the production and industrial application of PCA.KeywordsPseudomonas chlororaphis GP72-ND3phzO phenazine-1-carboxylic acid fermentation optimization central c
8、omposite design bioreactor吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是重要的吩嗪类次级代谢产物,具有广谱抗菌和环境友好等特点1。研究发现多种假单胞菌可以合成 PCA,如荧光假单胞菌 2-79、铜绿假单胞菌 M18、绿针假单胞菌 GP72 等1-2。野生菌株中 PCA 的产量通常较低,一般在 1 g/L 以下3-4。提高 PCA 产量的研究多集中在02第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-04-18;最后修回日期:2
9、022-05-07基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFA0904302)作者简介:刘桢桢,硕士研究生,研究方向为微生物发酵,E-mail:haibara-4869 通信作者:王威,博士,副教授,研究方向为微生物代谢工程与合成生物学、生物物质的分离纯化、农业生物药物等,E-mail:对野生菌株的改造方面,Fang 等5在铜绿假单胞菌PA1201 中敲除负调控 PCA 合成的基因 mvaU,将 PCA的产 量 提 高 了 0.5 倍,Song 等6在 针 假 单 胞 菌GP72ANO 中过表达甘油代谢途径的基因 glpF 和 glpK并阻断分流途径,将 PCA 的产量提高了 2.1 倍。关
10、于PCA 合成菌株的发酵优化策略的研究则较少,Bedoya等7优化铜绿假单胞菌 LV 的发酵培养基组分、温度和 pH 值,将 PCA 的产量提高为 113 mg/L,Du 等8优化铜绿假单胞菌 M18UMS1 的碳氮源种类及浓度,将PCA 的产量提高为 4 771 mg/L。绿针假单胞菌 GP72 是本实验室从甜椒根际土壤分离得到的一株生防菌株,能合成 PCA、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-hydroxy-phenazine-1-carboxylic acid,2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-hydroxyphenazin,2-OH-PHZ)3 种吩嗪类化合物4。本实验室参与研究开发的
11、以 PCA为主要成分的生物源农药“申嗪霉素”,对水稻纹枯病、西瓜枯萎病、辣椒疫病等都具有良好的防治效果,已注册获得农药准证9。该菌株中的单加氧酶基因phzO,可催化 PCA 羟基化生成 2-OH-PCA,而 2-OH-PCA 可以自发脱羧生成 2-OH-PHZ4,10-11。前期研究中,通过敲除菌株 GP72 中的 phzO 基因以及负调控吩嗪类化合物合成的基因 pykF、rpeA、rsmE 和 lon,获得了工程菌株 GP72-ND3phzO,在摇瓶发酵中 PCA 的产量由 22 mg/L 提升至 2 300 mg/L,是野生菌株的 90 多倍4,11。本文以菌株 GP72-ND3phzO
12、为研究对象,在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计(central composite design,CCD)实验优化PCA 的发酵培养基;于 1 L 反应器中在优化的培养基基础上优化发酵 pH 值,并在 5 L 反应器中进行放大培养。研究结果为该菌株应用于工业化生产 PCA 奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与培养基绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO,由本实验室构建并保藏。KB 液体培养基:胰 蛋白胨 20 g/L,甘油18.92 g/L,K2HPO4 0.514 g/L,MgSO4 0.732 g/L。KB固体培养基:在 KB 液体培养基中添加
13、 12 g/L 琼脂。1.1.2 主要仪器紫外分光光度计 UV-7504 购自上海精密仪器有限公司;高效液相色谱系统购自安捷伦科技(中国)有限公司;1 L 反应器及 5 L 反应器购自迪必尔生物工程(上海)有限公司。1.2 方法1.2.1 培养方法固体种子培养:将保存于-80 的菌株划线在 KB固体培养基上,28 倒置培养 36 48 h 后,用接种环挑取单菌落,再次划线在 KB 固体培养基上,28 倒置培养 16 h。液体种子培养:用接种环挑取固体种子单菌落,接种于含有 60 mL KB 液体培养基的 250 mL 凹角三角瓶中,200 r/min、28 恒温条件下培养 12 h。摇瓶发酵:
14、将液体种子按照 1%的接种量接种于含有 60 mL KB 液体培养基的 250 mL 凹角三角瓶,200 r/min、28 恒温条件下培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。1 L 反应器发酵:将液体种子培养基按照 6%的接种量接种于含有 600 mL 优化培养基的 1 L 反应器中,设置转速 700 r/min、通气量 2 vvm,28 恒温培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。5 L 反应器发酵:将液体种子培养基按照 6%的接种量接种于含有 3 L 优化培养基的 5 L 反应器中,设置通气量 3 vvm、转速 460 r/min,pH 根据优化结果设置,2
15、8 恒温培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。1.2.2 培养基优化(1)碳源对 PCA 产量的影响。以 KB 培养基为基准,考察碳源种类和浓度对 PCA 产量的影响。在18.92 g/L 的碳源起始浓度下,考察葡萄糖、甘油、淀粉和乙醇等 4 种碳源对 PCA 产量的影响;在 15、20、25、30、35 g/L 起始浓度下,考察碳源浓度对 PCA 产量的影响。(2)氮源对 PCA 产量的影响。以 KB 培养基为基准,考察氮源种类和浓度对 PCA 产量的影响。在20 g/L 的氮源起始浓度下,考察大豆蛋白胨、胰蛋白胨、棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、
16、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆、黄豆粉等 12 种氮源对 PCA 产量的影响;在 10、20、30、40、50 g/L 起始浓度下,考察氮源浓度对 PCA 产量的影响。(3)无机盐对 PCA 产量的影响。根据预实验确定KCl、MgSO4、K2HPO4 等 3 种考察对象和浓度范围。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、3、6、9 g/L 起始浓度下,考察 KCl 浓度对 PCA 产量的影响。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、0.5、1、1.5 g/L 起始浓度下,考察MgSO4浓度对 PCA 产量的影响。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、0.3、0.6、0.9 g/L 起始浓度下,考察K2H
17、PO4浓度对 PCA 产量的影响。(4)正交实验。根据单因素实验结果,以 X1-甘油(15 25 g/L)、X2-大豆蛋白胨(10 20 g/L)、X3-KCl(03 g/L)、X4-MgSO4(01.5 g/L)和 X5-K2HPO4(00.3 g/L)等 5 个因素为自变量,以发酵液中 PCA含量为响应值,选用 L8 正交表设计作为正交实验筛12第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023选的变量,从中筛选显著影响因素。其中每个因素取 2 水平:高水平“1”为范围区间最大值,低水平“-1”为范围区间
18、最小值。正交实验的具体因素和水平见表 1。(5)最陡爬坡实验。根据正交实验的一阶模型,筛选出大豆蛋白胨、甘油、KCl 和 K2HPO4共 4 个显著因素,在考虑交叉项的基础上根据显著因素的系数值确定最陡爬坡方向及步长12。最陡爬坡的方向是响应值增长最迅速的方向,爬坡路径的步长与回归系数成正比。显著因素的爬坡路径从正交实验的中心点开始并沿着爬坡方向和步长移动,非显著因素的浓度保持在中心点,找出 PCA 产量最大时的显著因素的浓度,作为中心组合设计实验的起始中心点。最陡爬坡实验的具体因素和水平见表 3。(6)中心组合设计实验。利用响应面实验可以评价显著因子之间的交互作用,以最陡爬坡实验结果作为中心
19、点,以甘油、大豆蛋白胨和 K2HPO4为自变量,以 PCA 产量为响应值,设计中心组合设计实验。三因素的中心 组合设计中 各因素的水 平点共有 5 个(-1.682、-1、0、1、1.682),实验组共 20 组,具体因素和水平见表 4。1.2.3 pH 对 PCA 产量的影响根据中心组合设计实验得到的最佳发酵培养基组分,在 1 L 反应器中,设置恒定 pH 值分别为 6.4、6.8、7.2、7.6,考察发酵 pH 值对 PCA 产量的影响。1.2.4 5 L 反应器的放大培养根据 1 L 反应器 pH 的优化结果,在 5 L 反应器中进行放大培养,同时与 1 L 反应器中的进行比较,考察不同
20、规模反应器中菌株生长和 PCA 合成的情况。1.2.5 PCA 产量的测定发酵液中 PCA 的提取和含量测定参照文献6的方法。取发酵液 1 mL,加入 50 L 6 mol/L 盐酸酸化后,加入 9 mL 乙酸乙酯振荡萃取 5 min,取 1 mL 萃取液吹干后加入 2.5 mL 乙腈溶解,以 HPLC 检测。HPLC 检测条件:使用 Agilent C18(2504.6 mm,5 m)色谱柱,流动相为乙腈和 0.1%甲酸水,流动相比例:04 min,20%乙腈-80%甲酸水,4.0120 min,乙腈浓度由 20%升至 40%,甲酸水浓度由 80%下降至60%,20.0125 min,20%
21、乙腈-80%甲酸水。检测波长254 nm,柱温 25,流速 1.0 mL/min。1.3 数据统计分析每个实验独立重复 2 次以上,每次实验中每个实验组平均重复 3 次,以“平均值标准差”形式表示结果。在单因素实验中,使用 Graphpad Prism 8.0 软件处理分析实验数据并作图,正交实验及中心组合实验设计使用 R-4.0.3 及 minitab 19 处理分析。使用单向方差分析(one-way ANOVA)分析组间差异性,使用 F 检验(P=0.01 或 P=0.05)确定显著差异。2 结果与分析2.1 碳源对 PCA 产量的影响菌株 GP72-ND3phzO 用不同碳源发酵 60
22、h 后,PCA 的产量见图 1(a)。可以看出,以甘油作为碳源时,PCA 的产量最高达到(2.440.09)g/L;以葡萄糖作为碳源时,PCA 的产量低于甘油为(1.870.06)g/L;以淀粉和乙醇作为碳源时,PCA 的产量极低仅为(0.270.03)g/L 和(0.170.03)g/L。菌株 GP72-ND3phzO以不同甘油浓度发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 1(b)。结果显示,随着甘油添加量的增加,PCA 产量先升高后降低,且甘油的添加量为 30 g/L 时,PCA 产量达到最高为(4.150.38)g/L,但进一步提高甘油浓度 PCA产量下降,因此选择添加量为 30 g/L
23、的甘油为最佳碳源。为显著差异(P0.05);为较显著(P0.01)。图 1 碳源种类和甘油浓度对 PCA 产量的影响Figure 1 Effects of carbon sources and glycerol concentration onPCA production2.2 氮源对 PCA 产量的影响菌株 GP72-ND3phzO 用不同氮源发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 2(a)。结果显示:以大豆蛋白胨作为氮源时,PCA 的产量最高达到(3.030.03)g/L;以胰蛋白胨作为氮源时,PCA 的产量低于大豆蛋白胨为(2.440.09)g/L;以棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽
24、、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆及黄豆粉作为氮源时,PCA 的产量均不足 2 g/L。因此选择大豆蛋白胨作为最优氮源。菌株 GP72-ND3phzO 以不同大豆蛋白胨浓度发酵 60 h 后,PCA的产量见图 2(b)。结果显示,大豆蛋白胨的添加量为 10 g/L 时,PCA 产量仅 1 g/L,可能是氮源不足导致菌株合成 PCA 受限,而当大豆蛋白胨的添加量为20 g/L 时,PCA 产量达到最高为(3.440.08)g/L,随着大豆蛋白胨的添加量进一步增加 PCA 产量逐渐降低,因此选择添加量为 20 g/L 的大豆蛋白胨为最佳氮源。22第 40 卷第 4 期2023 年 8
25、月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023(a)中 1:大豆蛋白胨;2:胰蛋白胨;3:棉籽粕;4:棉籽饼粉;5:黄豆饼粉;6:冷榨棉籽;7:牛肉膏;8:鱼粉蛋白胨;9:热榨棉籽;10:棕榈粕;11:玉米浆;12:黄豆粉。图 2 氮源种类和大豆蛋白胨浓度对 PCA 产量的影响Figure 2 Effects of nitrogen sources and soy peptone concentrationon PCA production2.3 无机盐对 PCA 产量的影响菌株GP72-ND3phzO以不同KCl浓度发酵60 h后,PCA 的
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