高山被孢霉低温应激条件下油脂代谢研究.pdf
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1、46油脂工程高山被孢霉低温应激条件下油脂代谢研究刘雯茜 2,王海军3,陈吴西,李德茂”,刘秀敏,李军(1.河北科技师范学院食品科技学院,河北秦皇岛0 6 6 6 0 0;2.中国科学院天津工业生物技术研究所,天津30 0 30 8;3.天津科技大学生物工程学院,天津30 0 30 8;4.河北交通职业技术学院粮食工程研发中心,河北石家庄0 50 0 35)摘要:对高山被孢霉在不同温度下的生物量、油脂产量和油脂组成等指标进行研究,并开展了比较代谢组学研究。结果表明:在低温处理(15)时,高山被孢霉的生物量和油脂含量均低于常温(2 5)处理。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量提高到了2.53
2、倍,而且极性脂中的不饱和脂肪酸含量提高到了1.32 倍,表明高山被孢霉的低温保护机制启动,大量合成极性脂和不饱和脂肪酸用于抵御低温应激。差异化合物筛选发现其中与油脂合成和降解有关的有10 个化合物,与糖酵解(EMP)途径有关的有6 个化合物,与氨基酸合成、降解和转运相关的化合物有5个。关键词:高山被孢霉;油脂;代谢组学;中性脂;极性脂Study on lipids metabolism of Mortierella alpinaLIU Wen-qian?,WANG Hai-jun?3,CHEN Wu-xi?,LI De-mao,LIU Xiu-min*,LI Jun(1.College of
3、Food Science and Technology,Hebei Normal University of Science and Technology,2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China;3.College of Biological Engineering,Tianjin University of Science and Technology,4.Grain Engineering Research and Development
4、 Center,Hebei Jiaotong Vocational andAbstract:The biomass,oil yield and oil composition of Mortierella alpina at different temperatures werestudied,and the comparative metabolomics was carried out.The results showed that the biomass and oilcontent of Mortierella alpina were lower at low temperature(
5、15 C)than at normal temperature(25 C).However,the content of polar lipids increased to 2.53 times at low temperature,and the content of un-saturated fatty acids in polar lipids increased to 1.32 times at low temperature,indicating that the lowtemperature protection mechanism was activated,and a larg
6、e number of polar lipids and unsaturated fattyacids were synthesized to resist low temperature stress.Differential compound screening showed that 10compounds were related to lipid synthesis and degradation,6 compounds were related to glycolysis(EMP)pathway,and 5 compounds were related to amino acid
7、synthesis,degradation and transport.Key words:Mortierella alpina;lipid;metabolomics;neutral lipid;polar lipid中图分类号:TS221粮食与油脂at low temperatures stressQinhuangdao 066600,Hebei,China;Tianjin 300308,China;Technical College,Shijiazhuang 050035,Hebei,China)文献标志码:A2023年第36 卷第8 期文章编号:10 0 8-9 57 8(2 0 2 3
8、)0 8-0 0 46-0 6收稿日期:2 0 2 2-0 4-0 7基金项目:国家重点研发计划(2 0 19YFA0904900);河北省果品加工技术创新中心绩效补助经费项目(2 2 56 7 6 115H)作者简介:刘雯茜(1998 一),女,硕士研究生,研究方向为食品加工与安全。通信作者:刘秀敏(197 8 一),女,博士,讲师,研究方向为农产品加工技术及微生物应用研究。李军(197 1一),男,博士,教授,研究方向为食品化学。2023年第36 卷第8 期高山被孢霉是土壤中常见的真菌,为无鞭毛菌门接合菌亚门毛霉目被孢霉科被孢霉属1-2 。高山被孢霉合成脂肪的能力极强,其脂肪含量能够达到总
9、菌体干重的50%左右,其中n-3不饱和脂肪酸占油脂总量的3%左右,n-6不饱和脂肪酸达到油脂总量的30%左右 3。高山被孢霉以乙酰辅酶A作为底物,合成油酸(OA)、亚油酸(LA)、-亚麻酸(G LA)、十八碳三烯酸(ALA)、二高-亚油酸(DH-GLA)、花生四烯酸(ARA)及二十碳五烯酸(EPA)等多种不饱和脂肪酸 4。长链多不饱和脂肪酸如ARA,不仅是生物膜的重要组成部分,在医学和制药领域还具有重要的功能,主要涉及人体免疫反应、生殖功能、血压调节、胆固醇代谢以及婴儿视网膜和大脑发育 5-10 等功能,而且还是多种类花生酸的前体物质,具有免疫抑制剂的作用 1-13。本文通过研究温度对高山被孢
10、霉代谢产物的影响,分析多不饱和脂肪酸受温度影响的代谢机制,为高山被孢霉菌种产多不饱和脂肪酸改造和产业化奠定基础。1材料与方法1.1材料与试剂高山被孢霉(Ma l p i n a A T CC 32 2 2),保存于中国科学院天津工业生物技术研究所实验室;正已烷(色谱纯)、琼脂粉(纯度99%),北京索莱宝科技有限公司;豆粕粉,天津市利发隆化工科技有限公司;浓HCI,廊坊拓迪化工有限公司;质量分数14%三氟化硼/甲醇溶液、饱和脂肪酸甲酯标准品,美国SICGMA公司;L-2氯苯丙氨酸(纯度98%),上海安谱科学仪器有限公司;葡萄糖、甲氧胺盐试剂、磷酸二氢钾、硫酸钠、无水甲醇、正已烷、乙腈、三氟乙酰胺
11、、CaCl,2H,O、M g Cl,6H,O、K O H、Na Cl,分析纯;马铃薯,市售。1.2仪器与设备Sw-cj-1fd超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;ZHL通风橱,青岛中浩林实验室装备科技有限公司;HVA-85高压灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;ZQZY-78CV恒温培养振荡器,上海知楚仪器有限公司;PAL-CAXXXLSM2纯水仪,美国PallCorpo-ration公司;SB-52000D超声波清洗机,宁波新艺生物科技股份有限公司;BPH-9140A恒温鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;MD200系列氮气吹扫仪,杭州奥盛仪器有限公司;HWCL-1恒温磁力搅拌器,郑州长城
12、科工贸有限公司;ME104E电子天粮食与油脂平,梅特勒-托利多国际有限公司;QL-861涡旋振荡器,上海旦鼎国际贸易有限公司;FD-1B-50真空冷冻干燥机,江苏天翎仪器有限公司;ZZJ-2030偏光显微镜,中正仪器有限公司;DZKW-D-2恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;SIGMA3-18K冷冻高速离心机、SIGMA1-16离心机,德国SIGMA公司;GC2010气相色谱仪,岛津企业管理(中国)有限公司;HA-300氢空一体机,北京中惠普分析技术研究所;Sp-2560气相毛细管柱、RTX-5气相毛细管柱,上海安谱科学仪器有限公司。1.3培养基的配制及发酵工艺1.3.1培养基配制PDA培养
13、基:马铃薯洗净去皮切块,称取2 0 0 g,加水10 0 0 mL煮沸0.5h,纱布过滤,加人葡萄糖20g、琼脂2 0 g,用蒸馏水定容至1L,于115高压蒸汽灭菌2 0 min。种子培养基:葡萄糖50.0 g/L、豆粉15.0 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、硫酸钠1.0 g/L,于115高压高温灭菌2 0 min。摇瓶发酵培养基:葡萄糖50.0 g/L、豆粕粉30.0g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、硫酸钠1.0 g/L、CaCl 2H,0 0.5 g/L、M g Cl 6H,0 0.5 g/L,于115高压高温灭菌2 0 min。1.3.2培养方法1.3.2.1孢子悬浮液的制备高山被孢
14、霉接种于PDA平板上,以2 5培养1周后制备孢子悬浮液。提前准备无菌去离子水、三角瓶、擦镜纸和漏斗,吸取无菌水到培养好的PDA平板上,用无菌的手术刀轻轻刮下孢子和菌丝,然后用移液枪吸取菌丝和孢子混合的菌液到无菌的三角瓶中,剧烈振荡之后,用4层灭过菌的擦镜纸进行过滤,同时调整孢子液的含量,使得最后获得的孢子悬浮液中孢子的含量为10 7 个/mL。1.3.2.2种子培养将2.5mL的孢子悬浮液接种到含有50 mL种子培养基的2 50 mL三角瓶中,然后以2 5、220r/min的条件培养8 4h,获得种子液。1.3.2.3摇瓶培养发酵将5mL的种子液转接到含有50 mL发酵培养基的2 50 mL三
15、角瓶中,以2 5、2 0 0 r/min的条件培养16 8 h,获得发酵液。1.4分析方法1.4.1生物量测定 144748移取10 2 0 mL(V)培养7 d的发酵液到已称重的50 mL离心管(m)中,以10 0 0 0 r/min离心10 min,沉淀用蒸馏水洗涤2 3次。将沉淀于-20冰箱预冻6 h,人冻干机冷冻干燥36 h,取出离心管及干菌体称重(m),按式(1)计算生物量。W=(1)V1.4.2油脂提取 15 称取破碎后干菌粉0.5g于50 mL玻璃瓶中,再加人蒸馏水、浓HCl各5 mL。将玻璃瓶于6 575水浴加热1 2 h,每隔2 0 min摇动混匀。水浴结束,加5mL正已烷振
16、荡摇匀,静置分层,取上层有机相。重复萃取3 5次,合并有机相,氮吹加热挥发除去溶剂即得油脂,称重。1.4.3油脂甲酯化 16 称量油脂0.1g,加0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液2 mL,以6 5水浴皂化2 0 min,冷却后加人三氟化硼-甲醇溶液4mL,以6 0 水浴3min,冷却至室温,加正已烷2 mL,振荡,加饱和氯化钠溶液2 mL,静置,取上清液 GC分析。1.5极性脂与中性脂的分离参考KOTAPATI等 17 的正相高效液相色谱法,使用已烷/异丙醇/甲醇/水溶液系统分离出PVASi1固定相上的中性脂和极性脂。1.6代谢组学分析1.6.1菌丝体制备设置TA、T B2 组完全相同的高
17、山被孢霉菌体,每组6 个平行。TA组以2 5培养7 d,TB组以15培养7 d,再将TA、T B组菌液以8 0 0 0 r/min离心5min,无菌水洗涤2 次,迅速放人液氮中速冻,置于-8 0 储存。1.6.2代谢物制备称取每组冻干好的菌丝体样品约6 0 mg,于室温下解冻样品,加人2 0 0 L水进行均质化。然后加入8 0 0 L甲醇/乙腈(体积比1:1),将混合物离心30s。在低温下对样品混合物进行2 次30 min的超声处理,在-2 0 下孵育1h后蛋白质沉淀。在13000r/min、4条件下离心15min,取上清液,冷冻干燥,并以-8 0 储存,备用。1.6.3代谢物衍生化及检测1.
18、6.3.1代谢物衍生化制备冷冻干燥后的代谢物,加50 L20mg/mL甲氧胺盐试剂,混匀,于35进行1.5h甲基化反粮食与油脂应。分别向制备好的代谢物样品中加人12 0 L三氟乙酰胺(含体积分数1%三甲基氯硅烷),将混合物置于6 9 下硅烷化1.0 h。冷却至室温后,加人15L饱和脂肪酸甲酯标准混合液(C。C16,1.0 mg/mL;Cis C30,0.5 mg/mL),过滤后上机m2-m1分析。1.6.3.2GC-MS 分析样品通过Agilent7890GC-MS分析,采用RTX-5MS WCOT毛细管柱(Restek,30 m 0.2 5 m m 0.25 m)。GC条件:上样量1L;不分
19、流进样;氮气流速1 mL/min;吹扫流速3mL/min;以15/min的速率将温度从8 0 升至310,维持10 min;前进样口温度2 8 0。MS条件:在EI模式下50 6 50 m/z范围内扫描获得质谱。1.6.4数据处理与多元分析数据处理参考文献 18 的方法,稍作修改。原始气相-飞行时间质谱联用仪(GC-TOF/MS)数据集使用Databridge应用程序管理器和Masslynx软件(4.1版,Warters Corp)进行预处理。使用来自NIST/EPA/NIH质谱库(2.0 版)的美国国家标准与技术研究院(NIST)质谱搜索程序将解析的 MS 光谱与参考质谱进行匹配。对使用SI
20、MCA-P软件12.0(U m e t r i c s,U m e a,Sw e d e n)处理生成的数据矩阵进行多变量分析。2结果及讨论2.1温度对油脂成分的影响由表1可知:与常温条件相比,在低温条件下高山被孢霉生物量、油脂含量和中性脂含量均降低,分别降低了12.7 1%、45.8 1%和30.9 9%,这应该是由微生物代谢活力在低温条件下降低导致的。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量升高,提高2.53倍。这表明高山被孢霉的低温保护机制启动,大量合成极性脂用于抵御低温逆境 19。表1不同温度下高山被孢霉生物量和油脂含量温度/生物量/(g/L)油脂含量/%极性脂/%15(低温)33.2
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