富含多种生物活性物质的桑黄菌筛选、纯种分离及鉴定.pdf
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1、齐鲁工业大学学报第 卷 第 期 年 月出版 .:./.【食品与生物工程】富含多种生物活性物质的桑黄菌筛选、纯种分离及鉴定王文卷 亓正良刘新利 李正阔陈若艳盛晓芸.齐鲁工业大学(山东省科学院).生物工程学院.生物基材料与绿色造纸国家重点实验室山东 济南.喜蕈菌物研究院山东 烟台 摘要:桑黄是一种具有悠久使用历史的药用真菌含有的多糖、黄酮、三萜、多酚等活性物质有很高的药用价值现代药理学证实其所含的某些活性物质在抗肿瘤方面具有良好的效果 首先测定了 个不同来源的桑黄样品(、)中的多糖、黄酮、三萜、多酚的含量综合对比不同样品中的活性成分含量筛选出一株富含上述活性成分的菌株 多酚、多糖、黄酮含量最高三萜
2、含量较高分别达到了(.)、(.)、(.)、(.)/且该菌为野生来源 之后对其进行了分离纯化及分子鉴定经鉴定 为一株粗毛纤孔菌()同时优化了活性物质的浸提方法发现体积分数为 乙醇对上述活性成分浸提效率较高关键词:桑黄活性成分分离鉴定提取方法中图分类号:文献标志码:文章编号:().().:.().(.)(.)(.)(.)/.:.桑黄多生长于树木枝干以生长于桑树树干最为典型其子实体呈现黑色或者黄褐色故其通常被称为桑黄 分类学上对其种属仍无明确的区分通常是属于锈革孔菌科()古时就有古籍收稿日期:网络出版时间:作者简介:王文卷硕士生研究方向:药用真菌通信作者:刘新利博士、教授研究方向:微生物资源开发及代
3、谢调控.齐鲁工业大学学报 年第 期记载了桑黄子实体的特征颜色及部分功效 在唐初甄权所著古籍药性论书中第一次出现了“桑黄”一词 桑黄在中医学中常被用于调理五脏、止血等 在现代药理学中桑黄所含有如萜类、多酚、多糖、黄酮等成分对于的抗氧化肿瘤的预防及抑制方面有较大的药用潜力 综上所述桑黄具有很高的研究与开发价值时至今日人们对于健康问题愈加重视养生以及日常的防护逐渐变得流行从以往的药补到食补逐渐转变为现在的药食同源 在药食同源的大趋势下一些具有抗肿瘤、抗氧化功效的天然药材或者天然菌种逐渐引起人们的重视而桑黄作为一种富含活性物质的菌种因其优秀的抗氧化能力提高免疫力的能力以及对于人体的修护能力逐渐展露于人
4、们的视野中本研究从河北承德、山东宁津及山东夏津桑树种植园中收集到 份桑黄样品(人工养殖或野生)对其进行活性成分的提取测定和纯种的分离鉴定通过测定样品的活性物质的含量筛选出品质优良的品种为桑黄来源药用成分的研究与开发提供较好的材料材料及实验方法.材料 份样品分别来自于山东夏津桑树园、山东宁津、河北承德等地由齐鲁工业大学生物工程学院保藏分别编号为、采集的子实体样本形态颜色各异呈黑色或者黄褐色伞盖成马蹄状子实体单生部分样品子实体表面光滑部分样品子实体表面有毛糙物 份样品的子实体形态如图 所示图 桑黄样品实体子形态.试剂和仪器使用北京天根生化公司植物基因组 提取试剂盒提取桑黄样本基因组 缓冲液():来
5、自广州硕普生物有限公司 琼脂糖:北京天根生化公司 纯化回收试剂盒:北京天根生化公司离心管、枪头等耗材:北京兰杰柯科技有限公司引物:由上海生物工程股份有限公司按照合成单加入 制成 /溶液马铃薯葡萄糖固体培养基():按照说明书进行配制液体培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基()型湘仪离心机:湖南湘仪公司 型电泳槽:北京六一生物科技有限公司 型凝胶成像系统:北京君意公司.型电子天平:上海卓精电子科技有限公司 磁力搅拌器:公司小型离心机:公司 型 梯度 仪(模块):北京天根生化公司 型全温振荡培养箱:苏州培英公司 电热恒温培养箱:上海精宏公司 型立式高压蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂 超净工作台:上海智城分
6、析仪器制造有限公司 年第 期王文卷等:富含多种生物活性物质的桑黄菌筛选、纯种分离及鉴定.桑黄菌纯种分离纯化在无菌条件下将活性成分含量均较高的 子样品用体积分数 酒精棉进行擦拭达到消毒的目的酒精棉不宜过于湿润以免多余酒精渗入影响桑黄菌活性 用酒精灯灼烧手术刀刀片进行消毒之后用刀片将子实体切开切开后再次灼烧刀片用刀片在切面中心割出方格以便之后用镊子夹取 用充分灼烧过的尖嘴镊子夹取已经切割好的子实体组织至 固体平板中将平板放入 培养箱避光培养每天对其生长状况及菌落形态进行记录 等平板上的桑黄组织萌发长成至菌落将桑黄菌落边缘的带有新鲜菌丝的培养基用充分灼烧后灭菌过的接种针转移至新的 平板中以达到分离纯
7、化的目的待形成单一菌落后在无菌条件下挑取培养基置于 培养基进行培养放入 摇床中避光培养待其形成较多菌丝球以备鉴定.基于 序列的分子鉴定.基因组 提取本实验采用植物基因组 提取试剂盒对桑黄样品 进行提取并按照其说明书操作.分子鉴定本研究采用 进行鉴定引物来自上海生工生物工程有限公司引物为 和(如表 所示)详细步骤见参考文献引物序列见表 及扩增体系见表 表 桑黄菌株鉴定通用引物引物名称引物序列()扩增序列扩增长度内转录间隔区 和 左右表 扩增体系组分及构成序号组分体积/加 至.样品预处理将 至 号样品子实体切取部分(切取子实体的质量烘干后需大于)并切割成直径 左右的碎块称取质量将碎块分别置于相应已
8、经编好 编号的容器中放入 烘箱中烘至衡重期间每隔 称取一次质量待质量不变后取出不宜烘干时间过长将烘干后的子实体碎块称取质量若质量不足则需要添加将质量充足的子实体碎块放入洁净的研钵中进行研磨研磨成细粉末需注意不能有较大的未研磨充分的子实体颗粒将研磨好的子实体粉末转移至标有相应编号的自封袋中封好袋口放入 冰箱中保存以备后续实验.标准曲线的绘制根据标准方法(/、/、/、/)绘制测定活性物质的标准曲线分别配置葡萄糖、芦丁、齐墩果酸标准品溶液、没食子酸标准储备液浓度梯度稀释后分别测出它们对应的吸光度以浓度为 轴吸光度为 轴做出标准曲线如图 所示具体操作步骤根据标准方法进行操作标准曲线结果如下多酚标准曲线
9、:.黄酮标准曲线:.葡萄糖标准曲线:.三萜标准曲线:.齐鲁工业大学学报 年第 期图 标准曲线.活性成分浸提方法优化本实验选取、等 个样品分别用体积分数 乙醇和无水乙醇对样品进行处理比较活性物质的浸提效果 同时为保证数据的准确性即吸光度数值尽可能控制在.对样品进行不同比例的稀释以控制吸光度在所要求的范围内 本实验先采用上述 个样品进行预实验一方面探求不同浓度乙醇的提取效果另一方面也为后续样品的稀释确定一个初步的稀释比例黄酮、多酚、三萜浸提方法优化:准确称取.菌体粉末加入体积分数 乙醇 超声提取 /离心 准确吸取上清液转移至 容量瓶沉淀用 乙醇重复提取两次提取方式相同将 次上清液分别转移至 容量瓶
10、中加入体积分数 乙醇定容至 用于黄酮、多酚、三萜浓度的测定 同时用无水乙醇代替体积分数 乙醇重复上述实验中的浸提方法比较提取效果后续检测黄酮、多酚、三萜时均比较体积分数 乙醇与无水乙醇的提取效果.多酚含量测定方法根据.所提到的标准方法对多酚进行检测.黄酮、多糖含量测定方法根据孙昊宇等对黄酮、多糖的检测方法进行检测.三萜含量测定方法三萜含量的检测方法详见.中的/.结论与分析通过对、等 个样品的活性成分的测定对比测量黄酮、多酚时的吸光度可以明显看出采用 乙醇处理的样品所测出的吸光度明显大于同等稀释比例下用无水乙醇处理样品的吸光度同时测定出了每个样品大致的稀释比例 所以剩下样品将采用 乙醇进行处理根
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