基于TLR4_MyD88_NF-κB信号通路探讨紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用.pdf
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1、湖南中医药大学学报Journal of Hunan University of Chinese Medicine1180本文引用:吴笛,蔺晓源,雷诗卉,姜帆,谭骏岚.基于TLR4/MyD88/NF-kB信号通路探讨紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用 湖南中医药大学学报,2 0 2 3,43(7):118 0-118 7.2023年7 月第43卷第7 期Jul.2023 Vol.43 No.7基于TLR4/MyD88/NF-kB信号通路探讨紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用吴笛1,2,蔺晓源1,2*,雷诗卉12,姜帆12,谭骏岚31.湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙410 0 0 7
2、;2.中医内科重大疾病防治研究及转化教育部重点实验室,湖南长沙410 0 0 7;3.湖南中医药大学,湖南长沙410 2 0 8【摘要】目的观察紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用,并基于Toll样受体4(Toll-likereceptors 4,TLR4)/髓分化因子8 8(myeloiddifferentiationfactor88,M y D 8 8)/核转录因子-kB(nuclearfactorkappa-B,NF-k B)信号通路探讨其作用机制。方法60只健康成年雄性SD大鼠随机分为6 组,每组10 只,除正常组外均采用气管内滴注脂多糖(lipopolysaccharides,LP
3、S)的方法建立慢性支气管炎模型。醋酸地塞米松组给予0.0 7 5mgkg醋酸地塞米松灌胃,每天1次;紫菀散低、中、高剂量组分别给予1.5、3.0、6.0gkg紫菀散灌胃,每天1次;模型组、正常组给予等量生理盐水灌胃。采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中转化生长因子-1(transforminggrowthfactor-1,T G F-1)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平,采用细胞计数板法计数BALF中白细胞数量,采用HE染色、AB-PAS染色观
4、察肺组织病理改变,采用免疫组化法检测肺组织TLR4、M y D 8 8、NF-k B蛋白表达。结果与正常组比较,模型组TGF-1、IL-1、IL-6 水平均升高(P0.01),白细胞总数和各种白细胞数量均增加(P0.01),肺组织呈病理改变且气道杯状细胞增生评分升高(P0.01),TLR4、M y D 8 8、NF-k B蛋白表达均升高(P0.01);与模型组比较,醋酸地塞米松组及紫菀散各剂量组TGF-1、IL-1、IL-6 水平均降低(P0.05或P0.01),白细胞总数和各种白细胞数量均降低(P0.01),肺组织病理改变均减轻,气道杯状细胞增生评分均降低(P0.05或P0.01),TLR4
5、、MyD88、NF-k B蛋白表达均减少(P0.05或P0.01);与醋酸地塞米松组比较,紫菀散中、高剂量组TGF-1水平均降低(P0.05或P0.01),紫菀散低剂量组白细胞总数和各种白细胞数量均增加(P0.01),紫菀散中剂量组中性粒细胞数量、嗜酸性粒细胞数量均增加(P0.01),紫菀散高剂量组淋巴细胞数量减少(P0.01),紫菀散低、中剂量组肺组织病理改变均加重,紫菀散低剂量组气道杯状细胞增生评分升高(P0.05),紫菀散低剂量组TLR4、M y D 8 8、NF-k B蛋白表达均升高(P0.05)。结论紫菀散可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-kB信号通路发挥抗慢性支气管炎气道炎症
6、的作用。【关键词】紫菀散;慢性支气管炎;气道炎症;TLR4/MyD88/NF-kB信号通路;转化生长因子-1;白细胞介素-1;白细胞介素-6【中图分类号】R285.5Intervention effects of Ziwan Powder on airway inflammation in chronicbronchitis based on TLR4/MyD88/NF-kB signaling pathway文献标志码 A【文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.005WU Di2,LIN Xiaoyuan2*,LEI Shihui?,JIANG
7、Fan,TAN Junlan?1.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.Key Laboratory of Researchon Prevention and Treatment of Major Diseases in Chinese Internal Medicine and Transformation of Achievements of Ministry ofEducation,Changsha,Hunan 410007,China;3.Huna
8、n University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,ChinaAbstract Objective To observe the intervention effects of Ziwan Powder on airway inflammation in chronic bronchitis,and【收稿日期】2 0 2 3-0 3-2 3【基金项目】湖南省自然科学基金科药联合基金项目(2 0 2 1JJ80067);湖南省国内一流培育学科 药学开放基金项目(2 0 2 1YX03)。【第一作者 吴笛,男,博士,高级工程师,硕士研究生导
9、师,研究方向:中药药效物质、作用机制研究与质量评价。【通信作者*葡晓源,男,博士,副研究员,硕士研究生导师,E-mail:。2023年第43卷to explore its mechanism based on toll-like receptor 4(TLR4)/myeloid differentiation factor 88(MyD88)nuclear factor-kB(NF-kB)signaling pathway.Methods Sixty healthy adult male SD rats were randomly divided into 6 groups,with 10 i
10、n each group.Theywere induced into chronic bronchitis models by instiling lipopolysaccharides(LPS)into the trachea,except for those of normalgroup.Dexamethasone Acetate group was given once daily gavage of 0.075 mgkg Dexamethasone Acetate.Once daily gavage of1.5,3.0 and 6.0 gkg extracts of Ziwan Pow
11、der were given to low-,medium-,and high-dose Ziwan Powder groups,respectively.The equal gavage of normal saline was administered to model group and normal group.The levels of transforming growth factor-1(TGF-1),interleukin-1(IL-1B),and interleukin-6(L-6)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were meas
12、ured by ELISA.Whiteblood cell count in BALF was checked by hemacytometer.Lung tissue pathological changes were observed by HE and AB-PASstaining,The protein expressions of TLR4,MyD88,and NF-kB in lung tissues were observed by immunohistochemistry staining.Results Compared with normal group,model gro
13、up showed higher levels of TGF-1,IL-1,and IL-6(P0.01),elevated count oftotal white blood cells,macrophages,lymphocytes,neutrophil granulocytes,and eosinophil granulocytes(P0.01),increased proteinexpression levels of TLR4,MyD88,and NF-kB(P0.01),a higher pathological score of airway goblet cell hyperp
14、lasia(P0.01),andobvious pathological changes in lung tissues.Compared with model group,Dexamethasone Acetate group and all Ziwan Powdergroups shared lower levels of TGF-1,IL-1,and IL-6(P005 or P0.01),reduced count of total white blood cll,macrophages,lymphocytes,neutrophil granulocytes and eosinophi
15、l granulocytes(P0.01),decreased protein expression levels of TLR4,MyD88,andNF-kB(P0.05 or P0.01),a lower pathological score of airway goblet cell hyperplasia(P0.05 or P0.01),and improved pathologicalchanges in lung tissues.Compared with Dexamethasone Acetate group,medium-and high-dose Ziwan Powder g
16、roups shared a lowerlevel of TGF-1(P0.05 or P0.01);low-dose Ziwan Powder group showed elevated count of total white blood cells,macrophages,lymphocytes,neutrophil granulocytes,and eosinophil granulocytes(P0.01),increased protein expression levels of TLR4,MyD88,andNF-kB(P0.05),and an increased number
17、 of airway goblet cells(P0.05);medium-dose Ziwan Powder group showed elevated countof neutrophil granulocytes and eosinophil granulocytes(P0.01);high-dose Ziwan Powder group showed reduced count of lymphocytes(P0.01);low-dose and medium-dose Ziwan Powder groups shared aggravated pathological changes
18、 in lung tissues.ConclusionZiwan Powder may alleviate airway inflammation in chronic bronchitis by inhibiting the TLR4/MyD88/NF-kB signaling pathway.Keywords Ziwan Powder;chronic bronchitis;airway inflammation;TLR4/MyD88/NF-kB signaling pathway;transforminggrowth factor-l;interleukin-1;interleukin-6
19、慢性支气管炎是由于感染或非感染性因素导致的气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症,以咳嗽、咳痰或伴有喘息等反复发作为主要症状,可并发阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动脉高压等常见并发症,严重影响患者正常的生活和工作-2。慢性支气管炎在我国是一种常见病、多发病,患者多为中老年人,且患病率随年龄增长而增加,我国50岁以上人群患病率超过14%3。目前,临床常采用抗感染、抗炎、止咳、化痰等措施治疗慢性支气管炎,但易反复发作。虽然慢性支气管炎的发病机制尚未完全阐明,但有研究 4-显示,Toll样受体4(toll-likereceptors 4,TLR4)/髓分化因子 8 8(myeloid dif
20、feren-tiation factor88,M y D 8 8)/核转录因子-kB(nuclearfactorkappa-B,NF-k B)信号通路是其发病的重要机制之一。紫菀散为古代经典名方,方出孙思渺备急千金要方卷十八“大肠腑方”,由紫菀、款冬花两味中药组成,能止咳化痰,主治咳嗽日久,痰涎不利。此方现多用于治疗慢性支气管炎,可随证加减,疗效确切,但鲜见紫菀散治疗慢性支气管炎的实验研究,故其湖南中医药大学学报http:/1181具体机制尚不明确。李聪等通过小鼠毛细血管通透性实验、氨水致小鼠急性呼吸道炎症模型及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞释放一氧化氮的变
21、化来观察紫菀、款冬花部位配伍后的抗炎作用,结果显示,紫菀90%醇沉部位、款冬花90%醇溶部位及其配伍均能抑制小鼠毛细血管通透性和氨水致敏引起的急性呼吸道炎症,配伍组作用增强;紫菀9 0%醇沉部位、款冬花9 0%醇溶部位均能抑制LPS刺激巨噬细胞后一氧化氮的产生,配伍后作用增强。此研究证实紫菀、款冬花均具有显著的抗炎作用,两者配伍后抗炎效果显著提高,符合相须、相使配伍理论,但未涉及作用机制。本研究拟观察紫菀散对LPS诱导的大鼠慢性支气管炎气道炎症的干预作用,并基于TLR4/MyD88/NF-kB信号通路探讨其作用机制。1材料1.1实验动物60只成年健康雄性SD大鼠,SPF级,体质量(20020)
22、g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公1182司,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2 0 19-0 0 0 4,饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验动物房,饲养环境温度为2 4 2 6,相对湿度为50%60%,光照周期为各12 h明暗交替,用全价颗粒饲料饲养,自由饮水、进食。实验单位使用许可证编号:SYXK(湘)2 0 2 0-0 0 10。实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准,伦理审查号:ZYFY20220321。1.2药品及试剂紫菀、款冬花均购于湖南邵东廉桥药材市场,经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定,分别为菊科植物AstertataricusL.f.
23、的干燥根和根茎、菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾;醋酸地塞米松片(浙江仙制药股份有限公司,国药准字:H33020822,规格:0.7 5mg,批号:2 0 0 12 4)。95%乙醇(成都市科隆化学品有限公司,批号:2021101902);LPS(美国Sigma-Aldrich公司,批号:L4516);戊巴比妥钠(上海伊卡生物技术有限公司,批号:57 0 47 1);生理盐水(上海生工生物工程股份有限公司,批号:2 2 0 316);4%多聚甲醛通用型组织固定液(北京兰杰柯科技有限公司,批号:2 1313432);瑞氏姬姆萨染色液(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号:C
24、R2102001);苏木精染色液、伊红染色液、阿辛兰-过碘酸希夫染色液(北京索莱宝科技有限公司,批号:2 0 2 2 0 2 2 4、2 0 2 2 0 32 3、2 0 2 112 16);大鼠转化生长因子-1(transforming growth factor-1,TGF-1)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)E LISA 试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司,批号:2 2 0 4R11、2 2 0 4R 13、2204R19);一抗兔抗鼠TLR4、M y D 8 8、NF-k B抗体(英国Abcam公司,批号:a
25、b220312ab220320.ab220405);二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulinG,I g G)抗体(英国Abcam公司,批号:GR231489-7)。1.3实验仪器Enspire型多功能酶标仪(美国Perkinelmer公司);H1850型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);DSX100型光学显微镜(日本Olympus公司);STP-120型组织脱水机、HM325型轮转式组织切片机、HistoStar型石蜡包埋机、GeminiAS型染色机(美国ThermoFisher公司)。2方法2.1药液制备取54g紫菀、8 1g款冬花,混合,依次
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