牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析.pdf
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1、2023 年 6 月第 3 期2332甘肃农业大学学报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY第5 8卷双 月 刊牛支原体 deoC 蛋白多抗的制备及生物信息学分析蔡伟,胡永浩(甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州 730070)摘要:【目的】研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株脱氧核糖磷酸醛缩酶(Deoxyribose-phosphate aldolase protein,DERA)基因序列特征及其分布位置,对免疫原性做初步探究。【方法】参照GenBank PG45菌株deoC 基因(登录号:CP002188.1)设计
2、引物 PCR 扩增 deoC 基因全长,构建原核表达载体 pET-deoC。经感受态BL21转化IPTG诱导后纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用Western blot与间接ELISA检测对其免疫原性和细胞内的分布进行初步研究。【结果】deoC 基因全长为 669 bp,重组蛋白为可溶性形式;Western blot与间接ELISA结果具有较高的免疫原性,在细胞质中分布多于细胞膜。与地方株同源性均为95.4%,亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构,存在磷酸化位点和糖基化位点,混合型二级结构。【结论】deoC具有良好的免疫原性,为研究牛支原体抗原提供了一定的理论基础依据。关键词:牛支原体;deoC
3、基因;基因克隆;生物学信息分析中图分类号:S852.62 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号:1003-4315(2023)03-0023-10Preparation and bioinformatic analysis of polyclonal antibody to the deoC protein of Mycoplasma bovisCAI Wei,HU Yonghao(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 7300070,China)Abstract:【
4、Objective】The aim of the experiment was to study the sequence characteristics and distribution of the deoxyribose-phosphate aldolase protein(DERA)gene of Mycoplasma bovis Wuwei strain and to preliminarily investigate the immunogenicity.【Method】Primers were designed according to the deoC gene of the
5、PG45 strain in GenBank(accession number:CP002188.1),and the full-length deoC gene was obtained by PCR and the prokaryotic expression vector pET-deoC was constructed.After transformation of E.coli BL21 competent cells,the purified protein was induced by IPTG and New Zealand rabbits were immunized to
6、produced polyclonal antiserum.Western blot and indirect ELISA were used to determine the immunogenicity and intracellular distribution.【Result】The deoC full-legth gene was 669 bp,and the recombinant protein was soluble;Western blot and indirect ELISA results showed that it had high immunogenicity an
7、d was distributed more in the cytoplasm than in the cell membrane.The homology with local strains was 95.4%,hydrophilic protein,no signal peptide and transmembrane structure.There are phosphorylation sites DOI:10.13432/ki.jgsau.2023.03.004第一作者:蔡伟,硕士研究生。E-mail:通信作者:胡永浩,博士生导师,研究方向为畜禽传染病学及病原分子生物学,动物防疫与
8、检疫。E-mail:基金项目:甘肃农业大学学科建设专项基金(GSAU-XKJS-2018-075);甘肃省重大专项(21ZD3NA001);甘肃省科技重大专项计划项目21ZD3NA001)。收稿日期:2022-03-18;修回日期:2022-04-05甘肃农业大学学报2023 年and glycosylation sites,mixed secondary structure.【Conclusion】deoC has good immunogenicity,which provides a theoretical basis for studying of M.bovis antigen.Ke
9、y words:Mycoplasma bovis;deoC gene;gene cloning;biological information analysis牛支原体呈世界性分布,其中对于发展中国家的养殖业和经济造成了明显的挑战1。牛支原体主要引起牛群发生牛呼吸系统疾病、关节炎以及生殖系统等疾病,发病特点以高热不退,呼吸困难、肺炎、四肢跛行、和母畜流产等为特征2。牛支原基因组存在可变蛋白基因,在不同的地域空间可以进化出不同的种株。随着国内引进新品种和与其他国家贸易往来1910 年传播进我国,2008年牛支原体爆发对我国的养牛业发展影响日益严重3。湖北、宁夏、新疆等地区出现以地方为代表的新型地方
10、株:MJ1株,16M 株,HB0801-P180,150,115 株,NM2012 株,CQ-W70 株等4。目前在针对牛支原体的疫苗研究,美国是唯一一个在牛支原体疫苗研究方面取得成熟技术并且商品化的国家,该技术未成熟之前美国牛支原体感染率高达 70%,将近损失 1.1 亿美元5-6。deoC 基因蛋白(Deoxyribose-phosphate aldolase protein,DERA 脱 氧 核 糖 磷 酸 醛 缩 酶)属 于deoC/FbaB 醛缩酶家族7。该类家族成员广泛的存在于各种生物中,其中在鼠类,人类以及多种哺乳动物都存在,但是在哺乳动物中这种蛋白质从未被正式确定8。醛缩酶家族
11、成员根据严格的供体机制可以分为两大类:I类醛缩酶和II类醛缩酶9。目前已经发现30 余种醛缩酶,其中I类醛缩酶主要是存在于动物以及高级植物;II类醛缩酶主要存在于真菌以及细菌之中;相对于前者,后者酶类生物活性显得更为稳定,对于供体的选择通常以三分子的乙醛为底物,最后生成2,4,6脱氧已糖。蒋仁新发现脱氧核糖磷酸醛缩酶(deo C)与p59可以发生相互作用,与其他互作蛋白功能相比较发现均为碳水化合物摄取相 关,例 如 ABC 转 运 蛋 白 2(ADR24785.1、ADR25073.1)、ABC转 运 器 组 成 蛋 白(ADR25021.1)、胞苷脱氨酶(cdd)、脱氧核苷激酶(ADR249
12、31.1、ADR25021.1)和 p48 脂 蛋 白(ADR24695.1)等10。与其他的醛缩酶类相比较,在底物结合的过程可以连续的进行醛缩反应。催化过程中通过共价键将底物和活性部分的氨基酸结合,形成 Shiff碱,引发键的断裂和形成11-12;Han 发现deoC 基因编码的脱氧核糖醛缩酶可能通过分解细胞外基质中的 eDNA,增强生物膜再生成功能13。根据现有研究证实该蛋白多存在于无法自身利用或者生成ATP的细胞,这类细胞用来利用细胞外脱氧肌苷来将脱氧核糖磷酸转化为甘油醛磷酸和乙醛维持自身ATP的动态平衡的生成。DERA催化合成相比较与其他催化反应的优势在于 反应条件专一且过程温和,转化
13、率高于同类催化以及反应产物单一纯粹,不会有对应异构体出现14,因此DERA催化的研究具有学术实际意义。目前关于牛支原体deoC蛋白的报道和研究较少,本研究将弥补这一空缺,对此进行预测和分析,以期对该蛋白特性以及功能提供一定的理论基础。本研究利用牛支原体武威株 deoC 基因进行克隆转化和生物学信息分析,以期对该蛋白的功能和牛支原体的预防治疗提供科学的参考依据。目前对于牛支原体deoC蛋白的研究较少,该基因对生物体的致病机理不清楚和蛋白功能尚不明确,因此本研究deoC基因作为研究出发点,对其序列克隆分析,推测其特性和国际标准株的进化关系,进一步为牛支原体的预防和治疗提供参考指导。1材料与方法1.
14、1菌株菌株牛支原体武威分离株由甘肃农业大学传染病学实验室保存;原核表达载体pET-28a(+)由甘肃农业大学传染病实验室分离和保存。1.2主要试剂限制性核酸内切酶以及连接酶,TaKaRa有限公司产品;DNA marker与预染蛋白质分子质量标准,Thermo公司产品;质粒小提试剂盒,天根生化科技公司产品;琼脂糖,北京擎科生物公司产品;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,Sigma公司产品;蛋白酶抑制剂与显色试剂盒,北京索莱宝科技有限公司产品;BCA蛋白定量试剂盒与羊抗兔HRP-IgG,碧云24第 3 期蔡伟等:牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析天生物公司产品;支原体培养基基础,青岛海博生
15、物技术有限公司产品。1.3方法1.3.1deoC基因引物设计参照GenBank PG45菌株 deoC 基因(CP002188.1)设计特异性引物(表1),使用Snapgene软件设计引物并分别在引物上游添加BamH酶切位点Xho酶切位点Xho酶切位点 以 及 保 护 碱 基 对。引 物 序 列 为 deoC-F:5-CGCGGATCCATGAAAATTGATTACAACAAAATGAT(下划线为BamH酶切位点),deoC-R:5-TATCTCGAGCTAGTAGCCGCCGTGT GATTCTTT(下划线为Xho酶切位点),预计扩增产物大小669 bp。引物信息见表1,由北京擎科生物有限公
16、司合成。1.3.2菌液以及基因的提取从-80 冰箱取出牛支原体分离株复苏接种于支原体培养基中,在37,5%CO2中培养4872 h。取新鲜的牛支原体菌液 2 L 在 4,12 000 r/min 的条件下离心8 min,弃上清,加入1 L无菌PBS将沉淀悬浮,上述操作方法重复3次,最终用100 L PBS悬浮,沸水煮沸8 min,立即放在冰上冰浴6 min,12 000 r/min离心后上清为粗提基因组,-20 保存备用。1.3.3deoC 全长基因的扩增上述粗提的总DNA为模板,使用引物deoC-F与deoC-R扩增全长deoC 基因(669 bp),扩增程序:95 ,5 min;95 ,1
17、 min;55 ,45 s;72 ,1 min,共35 个循环。扩增反应体系如下:2PCR MIX 20 L、DNA 模板4 L、上下游引物各1.5 L、dd水补足至40 L。最后应用12 g/L琼脂凝胶对PCR产物电泳后回收。1.3.4pET-deoC 的载体构建分别对 pET-28a和deoC全长片段分别提取质粒后用BamH和Xho内切酶进行分别过夜酶切后回收构建pET-deoC质粒,酶切体系为:全长 deoC 基因片段(或质粒)20 L,BamH 2 L,Xho 2 L,10K Buffer 4 L,加dd补足40 L。酶切产物回收后过夜连接,转化进DH5a感受态细胞内,琼脂电泳结果判断
18、是否大肠杆菌是否含有特有质粒。将验证成功的将验证为阳性的质粒送往北京擎科生物公司测序。1.3.5重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定按照上述成功转化的方法将pET-deoC转化至BL21感受态细胞,在培养基上挑取多个单菌落于2 L 2-YT培养液中震荡培养至D600到0.6时,加入诱导剂IPTG 至终浓度 0.1 mol/L,16 震荡培养 16 h,12 000 r/min过夜培养,分别取1 L于1.5 L离心管,其他的放置冰箱备用。在12 000 r/min后弃掉上清,用适量1xPBS悬浮并加20 L 5蛋白上样缓冲液混匀后水浴15 min,冰上冷却5 min后离心经进行SDS-PAGE分析。1
19、.3.6表达产物的纯化将上述 SDS-PAGE 分析表达量高的菌液转接于200 mL的2-YT培养液中,按照上述方法进行等比例扩大培养后经 4,12 000 r/min离心条件后弃掉上清,沉淀用PBS重悬3次后加入适量Binding Buffer 悬起在冰上破碎,破碎条件如下:功率 200 W,工作时间 3 s,停歇时间4 s,时间35 min。直至破碎上清液清亮,用HIS标签的Ni柱进行纯化,分别制样进行SDS-PAGE分析。1.3.7多抗血清的制备以及免疫原性分析新西兰兔正常喂养7 d后,观察其生理状态无异常情况用于制备deoC蛋白多抗血清,确认无误后采取少量血液制作阴性血清。将经纯化定量
20、的deoC重组蛋白取800 g,与佐剂一比一等体积的充分乳化后对新西兰兔进行背部皮下点射免疫。14 d后取纯化蛋白表1deoC基因引物序列Table 1Primer sequence of deoC gene基因GenedeoC引物序列Primer sequenceF:CGCGGATCCATGAAAATTGATTACAACAAAATGATR:TATCTCGAGCTAGTAGCCGCCGTGTGATTCTTT退火温度Annealing temperature55产物长度Size of the products669字母斜体表示保护碱基对,横线分别表示BamH酶切位点和Xho酶切位点Incline
21、d letters represent protective base pairs and transverse lines represent BamH and Xho sites,respectively.25甘肃农业大学学报2023 年deoC 400 g同样一比一等体积的不完全佐剂充分混匀,按照二免时用的剂量以及佐剂每7天一个周期免疫并采血测效价,同上一次效价相比不再上升就停止免疫并分离血清后-20 保存备用,并用于Western blot分析其蛋白的免疫原性。1.3.8deoC蛋白在牛支原体细胞内的分布将牛支原体扩大培养至100 L支原体培养基中,待到培养至后期8 000 r/min
22、离心30 min后,PBS洗涤后将沉淀重悬后取少量制成全菌蛋白,使用TritonX-114法分离膜蛋白和胞浆蛋白,将提取好的膜蛋白和胞浆蛋白分别包被酶标板,低温过夜后用PBST洗涤3次后每孔加入200 L的5%脱脂乳,37 孵育2 h,PBST洗涤3次后将多抗血清以1 1 000 稀释后加入每孔孵育1 h。PBST洗涤3次,加入1 8 000 稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,100 L/孔,37 孵育h后PBST同上洗涤次,每孔避光加入100 L TMB底物显色液,于室温避光显色15 min后加入H2SO4溶液终止反应,平行试验3 次取平均值,同时设立阴性对照和空白对照。1.3.9deoC蛋白
23、生物信息学分析将正确的阳性菌送往北京擎科生物有限公司测序后将测序,使用在线软件比对结果在 NCBL 上对 deoC 基因进行Blast后分析;使用DNAMAN将标准株P45和其他不同来源的的菌株deoC基因进行对比;利用DNA star进行构建进化树;应用ExPASy-Prot-Param对蛋白理化性质进行预测;应用 InterPro进行预测蛋白疏水域;应用SignaIP(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测蛋白信号肽;使用 TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)
24、预测蛋白跨膜结构;应用NetPhos-3.1(https:/www.dtu.dk/english)预测蛋白的磷酸化位点和糖基化位点;应用 Smart(http:/smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白二级结构;应用 Swiss-MODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)预测蛋白 三 级 结 构;应 用 在 线 工 具 Swiss-MODEL 和PROCHECK软件对三级结构进行拉曼图分析。2结果与分析2.1PCR扩增以及测序利用PCR技术成功的扩增一条大小约为669 bp的条带(图1),测序结果与双酶切鉴定预期大小一致(图2),成功克隆deo
25、C基因,其蛋白由222 个氨基酸编码组成。2.2deoC蛋白的少量诱导以及纯化SDS-PAGE目的蛋白插入 pET-28a 载体后分子量约为24.2 ku,在16 低温诱导16 h后经SDS-PAGE分析:少量诱导纯化前全菌样(图3)和大量诱导纯化后(图4)的蛋白大小在预期结果25 ku处,与预期结果相符。2.3Western blot免疫原性分析Western blot显示:目的区有特异性性条带且与预期一致(图5),表明该蛋白可以特异性结合和具有良好的免疫反应性。M1:DL 2 000 Marker;1:deoC目的基因片段。M1:DL 2 000 Marker;1:deoC target
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