牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析.pdf

2023 年 6 月第 3 期2332甘肃农业大学学报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY第5 8卷双 月 刊牛支原体 deoC 蛋白多抗的制备及生物信息学分析蔡伟，胡永浩（甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070）摘要：【目的】研究牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）武威株脱氧核糖磷酸醛缩酶（Deoxyribose-phosphate aldolase protein，DERA）基因序列特征及其分布位置，对免疫原性做初步探究。【方法】参照GenBank PG45菌株deoC 基因（登录号：CP002188.1）设计引物 PCR 扩增 deoC 基因全长，构建原核表达载体 pET-deoC。经感受态BL21转化IPTG诱导后纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清，应用Western blot与间接ELISA检测对其免疫原性和细胞内的分布进行初步研究。【结果】deoC 基因全长为 669 bp，重组蛋白为可溶性形式；Western blot与间接ELISA结果具有较高的免疫原性，在细胞质中分布多于细胞膜。与地方株同源性均为95.4%，亲水性蛋白，无信号肽和跨膜结构，存在磷酸化位点和糖基化位点，混合型二级结构。【结论】deoC具有良好的免疫原性，为研究牛支原体抗原提供了一定的理论基础依据。关键词：牛支原体；deoC基因；基因克隆；生物学信息分析中图分类号：S852.62 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1003-4315（2023）03-0023-10Preparation and bioinformatic analysis of polyclonal antibody to the deoC protein of Mycoplasma bovisCAI Wei，HU Yonghao（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 7300070，China）Abstract：【Objective】The aim of the experiment was to study the sequence characteristics and distribution of the deoxyribose-phosphate aldolase protein(DERA)gene of Mycoplasma bovis Wuwei strain and to preliminarily investigate the immunogenicity.【Method】Primers were designed according to the deoC gene of the PG45 strain in GenBank(accession number:CP002188.1)，and the full-length deoC gene was obtained by PCR and the prokaryotic expression vector pET-deoC was constructed.After transformation of E.coli BL21 competent cells，the purified protein was induced by IPTG and New Zealand rabbits were immunized to produced polyclonal antiserum.Western blot and indirect ELISA were used to determine the immunogenicity and intracellular distribution.【Result】The deoC full-legth gene was 669 bp，and the recombinant protein was soluble;Western blot and indirect ELISA results showed that it had high immunogenicity and was distributed more in the cytoplasm than in the cell membrane.The homology with local strains was 95.4%，hydrophilic protein，no signal peptide and transmembrane structure.There are phosphorylation sites DOI：10.13432/ki.jgsau.2023.03.004第一作者：蔡伟，硕士研究生。E-mail：通信作者：胡永浩，博士生导师，研究方向为畜禽传染病学及病原分子生物学，动物防疫与检疫。E-mail：基金项目：甘肃农业大学学科建设专项基金（GSAU-XKJS-2018-075）；甘肃省重大专项（21ZD3NA001）；甘肃省科技重大专项计划项目21ZD3NA001）。收稿日期：2022-03-18；修回日期：2022-04-05甘肃农业大学学报2023 年and glycosylation sites，mixed secondary structure.【Conclusion】deoC has good immunogenicity，which provides a theoretical basis for studying of M.bovis antigen.Key words：Mycoplasma bovis；deoC gene；gene cloning；biological information analysis牛支原体呈世界性分布，其中对于发展中国家的养殖业和经济造成了明显的挑战1。牛支原体主要引起牛群发生牛呼吸系统疾病、关节炎以及生殖系统等疾病，发病特点以高热不退，呼吸困难、肺炎、四肢跛行、和母畜流产等为特征2。牛支原基因组存在可变蛋白基因，在不同的地域空间可以进化出不同的种株。随着国内引进新品种和与其他国家贸易往来1910 年传播进我国，2008年牛支原体爆发对我国的养牛业发展影响日益严重3。湖北、宁夏、新疆等地区出现以地方为代表的新型地方株：MJ1株，16M 株，HB0801-P180，150，115 株，NM2012 株，CQ-W70 株等4。目前在针对牛支原体的疫苗研究，美国是唯一一个在牛支原体疫苗研究方面取得成熟技术并且商品化的国家，该技术未成熟之前美国牛支原体感染率高达 70%，将近损失 1.1 亿美元5-6。deoC 基因蛋白（Deoxyribose-phosphate aldolase protein，DERA 脱 氧 核 糖 磷 酸 醛 缩 酶）属 于deoC/FbaB 醛缩酶家族7。该类家族成员广泛的存在于各种生物中，其中在鼠类，人类以及多种哺乳动物都存在，但是在哺乳动物中这种蛋白质从未被正式确定8。醛缩酶家族成员根据严格的供体机制可以分为两大类：I类醛缩酶和II类醛缩酶9。目前已经发现30 余种醛缩酶，其中I类醛缩酶主要是存在于动物以及高级植物；II类醛缩酶主要存在于真菌以及细菌之中；相对于前者，后者酶类生物活性显得更为稳定，对于供体的选择通常以三分子的乙醛为底物，最后生成2，4，6脱氧已糖。蒋仁新发现脱氧核糖磷酸醛缩酶（deo C）与p59可以发生相互作用，与其他互作蛋白功能相比较发现均为碳水化合物摄取相 关，例 如 ABC 转 运 蛋 白 2（ADR24785.1、ADR25073.1）、ABC转 运 器 组 成 蛋 白（ADR25021.1）、胞苷脱氨酶（cdd）、脱氧核苷激酶（ADR24931.1、ADR25021.1）和 p48 脂 蛋 白（ADR24695.1）等10。与其他的醛缩酶类相比较，在底物结合的过程可以连续的进行醛缩反应。催化过程中通过共价键将底物和活性部分的氨基酸结合，形成 Shiff碱，引发键的断裂和形成11-12；Han 发现deoC 基因编码的脱氧核糖醛缩酶可能通过分解细胞外基质中的 eDNA，增强生物膜再生成功能13。根据现有研究证实该蛋白多存在于无法自身利用或者生成ATP的细胞，这类细胞用来利用细胞外脱氧肌苷来将脱氧核糖磷酸转化为甘油醛磷酸和乙醛维持自身ATP的动态平衡的生成。DERA催化合成相比较与其他催化反应的优势在于 反应条件专一且过程温和，转化率高于同类催化以及反应产物单一纯粹，不会有对应异构体出现14，因此DERA催化的研究具有学术实际意义。目前关于牛支原体deoC蛋白的报道和研究较少，本研究将弥补这一空缺，对此进行预测和分析，以期对该蛋白特性以及功能提供一定的理论基础。本研究利用牛支原体武威株 deoC 基因进行克隆转化和生物学信息分析，以期对该蛋白的功能和牛支原体的预防治疗提供科学的参考依据。目前对于牛支原体deoC蛋白的研究较少，该基因对生物体的致病机理不清楚和蛋白功能尚不明确，因此本研究deoC基因作为研究出发点，对其序列克隆分析，推测其特性和国际标准株的进化关系，进一步为牛支原体的预防和治疗提供参考指导。1材料与方法1.1菌株菌株牛支原体武威分离株由甘肃农业大学传染病学实验室保存；原核表达载体pET-28a（+）由甘肃农业大学传染病实验室分离和保存。1.2主要试剂限制性核酸内切酶以及连接酶，TaKaRa有限公司产品；DNA marker与预染蛋白质分子质量标准，Thermo公司产品；质粒小提试剂盒，天根生化科技公司产品；琼脂糖，北京擎科生物公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma公司产品；蛋白酶抑制剂与显色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；BCA蛋白定量试剂盒与羊抗兔HRP-IgG，碧云24第 3 期蔡伟等：牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析天生物公司产品；支原体培养基基础，青岛海博生物技术有限公司产品。1.3方法1.3.1deoC基因引物设计参照GenBank PG45菌株 deoC 基因（CP002188.1）设计特异性引物（表1），使用Snapgene软件设计引物并分别在引物上游添加BamH酶切位点Xho酶切位点Xho酶切位点 以 及 保 护 碱 基 对。引 物 序 列 为 deoC-F：5-CGCGGATCCATGAAAATTGATTACAACAAAATGAT（下划线为BamH酶切位点），deoC-R：5-TATCTCGAGCTAGTAGCCGCCGTGT GATTCTTT（下划线为Xho酶切位点），预计扩增产物大小669 bp。引物信息见表1，由北京擎科生物有限公司合成。1.3.2菌液以及基因的提取从-80 冰箱取出牛支原体分离株复苏接种于支原体培养基中，在37，5%CO2中培养4872 h。取新鲜的牛支原体菌液 2 L 在 4，12 000 r/min 的条件下离心8 min，弃上清，加入1 L无菌PBS将沉淀悬浮，上述操作方法重复3次，最终用100 L PBS悬浮，沸水煮沸8 min，立即放在冰上冰浴6 min，12 000 r/min离心后上清为粗提基因组，-20 保存备用。1.3.3deoC 全长基因的扩增上述粗提的总DNA为模板，使用引物deoC-F与deoC-R扩增全长deoC 基因（669 bp），扩增程序：95 ，5 min；95 ，1 min；55 ，45 s；72 ，1 min，共35 个循环。扩增反应体系如下：2PCR MIX 20 L、DNA 模板4 L、上下游引物各1.5 L、dd水补足至40 L。最后应用12 g/L琼脂凝胶对PCR产物电泳后回收。1.3.4pET-deoC 的载体构建分别对 pET-28a和deoC全长片段分别提取质粒后用BamH和Xho内切酶进行分别过夜酶切后回收构建pET-deoC质粒，酶切体系为：全长 deoC 基因片段（或质粒）20 L，BamH 2 L，Xho 2 L，10K Buffer 4 L，加dd补足40 L。酶切产物回收后过夜连接，转化进DH5a感受态细胞内，琼脂电泳结果判断是否大肠杆菌是否含有特有质粒。将验证成功的将验证为阳性的质粒送往北京擎科生物公司测序。1.3.5重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定按照上述成功转化的方法将pET-deoC转化至BL21感受态细胞，在培养基上挑取多个单菌落于2 L 2-YT培养液中震荡培养至D600到0.6时，加入诱导剂IPTG 至终浓度 0.1 mol/L，16 震荡培养 16 h，12 000 r/min过夜培养，分别取1 L于1.5 L离心管，其他的放置冰箱备用。在12 000 r/min后弃掉上清，用适量1xPBS悬浮并加20 L 5蛋白上样缓冲液混匀后水浴15 min，冰上冷却5 min后离心经进行SDS-PAGE分析。1.3.6表达产物的纯化将上述 SDS-PAGE 分析表达量高的菌液转接于200 mL的2-YT培养液中，按照上述方法进行等比例扩大培养后经 4，12 000 r/min离心条件后弃掉上清，沉淀用PBS重悬3次后加入适量Binding Buffer 悬起在冰上破碎，破碎条件如下：功率 200 W，工作时间 3 s，停歇时间4 s，时间35 min。直至破碎上清液清亮，用HIS标签的Ni柱进行纯化，分别制样进行SDS-PAGE分析。1.3.7多抗血清的制备以及免疫原性分析新西兰兔正常喂养7 d后，观察其生理状态无异常情况用于制备deoC蛋白多抗血清，确认无误后采取少量血液制作阴性血清。将经纯化定量的deoC重组蛋白取800 g，与佐剂一比一等体积的充分乳化后对新西兰兔进行背部皮下点射免疫。14 d后取纯化蛋白表1deoC基因引物序列Table 1Primer sequence of deoC gene基因GenedeoC引物序列Primer sequenceF:CGCGGATCCATGAAAATTGATTACAACAAAATGATR:TATCTCGAGCTAGTAGCCGCCGTGTGATTCTTT退火温度Annealing temperature55产物长度Size of the products669字母斜体表示保护碱基对，横线分别表示BamH酶切位点和Xho酶切位点Inclined letters represent protective base pairs and transverse lines represent BamH and Xho sites，respectively.25甘肃农业大学学报2023 年deoC 400 g同样一比一等体积的不完全佐剂充分混匀，按照二免时用的剂量以及佐剂每7天一个周期免疫并采血测效价，同上一次效价相比不再上升就停止免疫并分离血清后-20 保存备用，并用于Western blot分析其蛋白的免疫原性。1.3.8deoC蛋白在牛支原体细胞内的分布将牛支原体扩大培养至100 L支原体培养基中，待到培养至后期8 000 r/min离心30 min后，PBS洗涤后将沉淀重悬后取少量制成全菌蛋白，使用TritonX-114法分离膜蛋白和胞浆蛋白，将提取好的膜蛋白和胞浆蛋白分别包被酶标板，低温过夜后用PBST洗涤3次后每孔加入200 L的5%脱脂乳，37 孵育2 h，PBST洗涤3次后将多抗血清以1 1 000 稀释后加入每孔孵育1 h。PBST洗涤3次，加入1 8 000 稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100 L/孔，37 孵育h后PBST同上洗涤次，每孔避光加入100 L TMB底物显色液，于室温避光显色15 min后加入H2SO4溶液终止反应，平行试验3 次取平均值，同时设立阴性对照和空白对照。1.3.9deoC蛋白生物信息学分析将正确的阳性菌送往北京擎科生物有限公司测序后将测序，使用在线软件比对结果在 NCBL 上对 deoC 基因进行Blast后分析；使用DNAMAN将标准株P45和其他不同来源的的菌株deoC基因进行对比；利用DNA star进行构建进化树；应用ExPASy-Prot-Param对蛋白理化性质进行预测；应用 InterPro进行预测蛋白疏水域；应用SignaIP（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）预测蛋白信号肽；使用 TMHMM（http：/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白跨膜结构；应用NetPhos-3.1（https：/www.dtu.dk/english）预测蛋白的磷酸化位点和糖基化位点；应用 Smart（http：/smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白二级结构；应用 Swiss-MODEL（https：/swissmodel.expasy.org/）预测蛋白 三 级 结 构；应 用 在 线 工 具 Swiss-MODEL 和PROCHECK软件对三级结构进行拉曼图分析。2结果与分析2.1PCR扩增以及测序利用PCR技术成功的扩增一条大小约为669 bp的条带（图1），测序结果与双酶切鉴定预期大小一致（图2），成功克隆deoC基因，其蛋白由222 个氨基酸编码组成。2.2deoC蛋白的少量诱导以及纯化SDS-PAGE目的蛋白插入 pET-28a 载体后分子量约为24.2 ku，在16 低温诱导16 h后经SDS-PAGE分析：少量诱导纯化前全菌样（图3）和大量诱导纯化后（图4）的蛋白大小在预期结果25 ku处，与预期结果相符。2.3Western blot免疫原性分析Western blot显示：目的区有特异性性条带且与预期一致（图5），表明该蛋白可以特异性结合和具有良好的免疫反应性。M1：DL 2 000 Marker；1：deoC目的基因片段。M1：DL 2 000 Marker；1：deoC target gene fragment.图1deoC 基因PCR 扩增Figure 1PCR electrophoresis of deoC geneM：DL 2 000 Marker；1：重组质粒双酶切产物。M DL 2 000 Marker；1：Double digestion products of recombinant plasmid.图 2重组质粒双酶鉴定Figure 2Identification of recombinant plasmid by double enzyme26第 3 期蔡伟等：牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析2.4蛋白的定位分析间接ELISA结果显示：deoC蛋白在细胞膜和细胞质都存在，且细胞质的含量高于细胞膜（图6）。2.5deoC蛋白生化信息预测2.5.1序列同源性比对将测序结果在NCBL进行blast结果显示；牛支原体武威株deoC基因和国内分 离 株 MJ1 株，XBY01 株，16M 株，08M 株，HB0801-P180，150，115 株，NM2012 株，CQ-W70株同源性为95.4%，和国际标准株PG-45株同源性为42.4%（图7），此外进化树分析显示，deoC基因和国内分离株距离较近，似乎与国内分离株属于同一进化分支（图8）。2.5.2理化性质deoC蛋白由222 个氨基酸所编码，蛋白分子蛋白分子大小约为 24.2 ku，分子式C1074H1746N276O331S13，理论等电点（pl）为 6.45，由 222 个氨基酸构成，其中酪氨酸最多（12.2%），带负电荷的残基总数（Asp+Glu）共31 个（表2），带正电荷的残基总数（Arg+Lys）共30 个，半衰期约为30 h，不稳定指数是 23.42（40 为稳定蛋白），属于稳定蛋白。M：预染蛋白分子质量标准；17：pETdeoC 诱导后全菌；8：pET-28a（+）空载。M：Molecular quality standard of pre stained protein；17：Whole bacteria induced by pETdeoC；8：pET28a（+）empty carrier.图3少量诱导重组蛋白的SDS-PAGE电泳Figure 3SDS-PAGE electrophoresis of a small amount of induced recombinant proteinM：预染蛋白分子质量标准；1：IPTG诱导后全菌；2：IPTG诱导pETdeoC表达菌上清；3：IPTG诱导pETdeoC表达菌沉淀；47：纯化的重组蛋白pETdeoC；8：IPTG诱导pET28a（+）表达菌。M：Molecular quality standard of Predyed protein；1：Whole bacteria after 1.IPTG induction；2：IPTG induced supernatant of pETdeoC expression bacteria；3：IPTG induced pETdeoC expression bacteria to precipitate 47 purified recombinant protein pETdeoC；8：IPTG induced pET28a（+）expression bacteria.图4His-deoC重组蛋白的纯化Figure 4Purification of His-deoC recombinant proteinM：蛋白质分子标准；1：pET28a 空载体对照；2：纯化后的 deoC 蛋白。M：Protein molecular standard；1：pET28a empty carrier control；2：Purified deoC protein.图5纯化后重组蛋白的鉴定Figure 5Identification of purified recombinant protein阴性对照：dd水；空白对照：免疫前血清；处理组：牛支原体重组蛋白抗血清。Negative control：dd water；Blank control：serum before immunization；Treatment group：Mycoplasma bovis recombinant protein antiserum.图6deoC在牛支原体细胞中的定位分析Figure 6Localization analysis of deoC in Mycoplasma bovis cells27甘肃农业大学学报2023 年2.5.3亲/疏水性分析亲/疏水性最大值是2.022（位于第61位氨基酸处），最小值为-2.333（位于第102位氨基酸处），总平均疏水性为-0.082（正值表示疏水，负值表示亲水），同时该蛋白含有大量亲水域，表明deoC蛋白为属于亲水性蛋白（图9）。2.5.4信号肽以及跨膜结构预测应用在线工具SingaLP5.0 对牛支原体deoC蛋白信号肽预测，结果显 示，该 蛋 白 不 存 在 信 号 肽（图 10）和 跨 膜 区（图11）。2.5.5磷酸化和糖基化预测利用在线软件对deoC蛋白序列进行预测，结果显示当潜在磷酸化位点阈值为0.5时，该蛋白存在19 个潜在的磷酸化的图 7deoC基因同源性比较Figure 7Comparison of homology of deoC gene图8deoC基因系统进化树分析Figure 8Phylogenetic tree analysis of deoC gene表2deoC 蛋白氨基酸组成Table 2Amino acid composition of deoC protein氨基酸Aminoacids丙氨酸Ala精氨酸Arg天冬酰胺Asn天冬氨酸Asp半胱氨酸Cys谷氨酰胺Gln谷氨酸Glu甘氨酸Gly组氨酸His异亮氨酸Ile亮氨酸Leu数量/个Number20361544161842013百分比/%Percentage9.01.42.76.81.81.87.28.11.89.05.9氨基酸Aminoacids赖氨酸Lys蛋氨酸Met苯丙氨酸Phe脯氨酸Pro丝氨酸Ser苏氨酸Thr色氨酸Trp酪氨酸Tyr缬氨酸Val吡咯懒氨酸Pyl硒半胱氨酸Sec数量/个Number279621314091900百分比/%Percentage12.24.12.70.95.96.304.18.600%28第 3 期蔡伟等：牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析位点（图12），其中丝氨酸9 个，苏氨酸8 个和1 个酪氨酸。预测该蛋白含有一个糖基化位点（图13）。2.5.6deoC蛋白的二级结构预测使用SOPMA在线软件对牛支原体deoC蛋白二级结构进行分析，结果如图所示，该蛋白主要是由46.85%的螺旋（H）、16.67%的e-延伸链、7.21%的-折叠（S）、和29.28%的无规则卷曲（L）等组成（图14）。2.5.7deoC 蛋白的三级结构预测在 SWISS-MODEL预测deoC蛋白三级结构模型（图15），选取相似性为50.92%（2-214位氨基酸残基）建立三级结构的单链空间建构模型（通常认为预测蛋白序列一致性30%的已知蛋白结构为模板）。与其模板结构GMQE值（数值最接近于1最佳）与QMEAN值（数值最接近于0最佳）分别为0.83、0.09，为了进一步 评 估 其 模 型 质 量 是 否 可 靠，分 别 用 Swiss-MODEL（图 16-A）和 PROCHECK（图 16-B）进行了拉曼图谱分析。统计分析结果显示，位于最适区、较合适区、可接受区和不合理区的氨基酸 残基数分别为 366、21、1 和 0，所占百分率分别为 94.3%、5.4%、0.3%和0%，共有100.0%的氨基酸残基位于图 9deoC蛋白亲/疏水性分析结果Figure 9Analysis results of hydrophilicity/hydrophobicity of deoC protein图 10deoC蛋白信号肽预测Figure 10Prediction of deoC protein signal peptide图11deoC蛋白的跨膜区预测Figure 11Prediction of transmembrane region of deoC protein图 12deoC蛋白蛋白磷酸化位点预测Figure 12Prediction of phosphorylation sites of deoC protein图13deoC蛋白蛋白糖基化位点预测Figure 13deoC protein protein glycosylation site predictionh：a螺旋；t：转角；：延伸链；：无规则卷曲。h：a spiral；t：Beta angle；e：Extending chain；c：Random curl.图 14deoC蛋白二级结构预测Figure 14Prediction of secondary structure of deoC protein29甘肃农业大学学报2023 年允许区，表明预测的 deoC蛋白质高级结构比较稳定，该模型较为可靠（图16）。3讨论由于牛支原体缺乏细胞壁，主要功能都是由细胞膜承担。细胞膜丰富的蛋白种类在生长代谢营养输送等各个方面起着重要作用15-17。Salleron等18 发现deoC蛋白在其他生物广泛存在，主要功能是参与代谢调节，通过催化磷酸二酯键来达到调节作用，催化乙醛和D-甘油醛3-磷酸之间的可逆羟醛反应，生成2-脱氧-D-核糖5-磷酸，是生物体内一种重要的调节过程。廖志夫19研究证实该蛋白还对于多种微生物是重要的调节生命功能的蛋白，还发现该蛋白除了在链球菌中参与对DNA的分解能力以外，还可以抑制其他生物生物膜形成来提高自身生物膜形成的能力，例如降低链球菌对口腔的黏附能力来提高自身的耐受性，有希望应用于治疗龋病。Liu等20发现在变形链球菌该蛋白通过介导生物膜扩散促进感染传播，以及通过NET降解促进变形链球菌从嗜中性粒细胞杀死中逃逸；此外在大肠杆菌内deoC蛋白可以发挥作用，在对正常生理状态下的细胞发生细胞凋亡时引起内环境钙离子和镁离子的浓度发生变化，浓度变化可作为引起脱氧核糖核酸内切酶发挥作用21-22，因此认为该基因可能和相关激活信号调节调节生物功能有关23-24。谢晓东等25认为，研究牛支原体表面膜蛋白功能以及用于早期的范围筛查，例如P81蛋白、P48蛋白、P26蛋白等。本研究成功的扩增全长基因，其编码222个氨基酸；与地方株（MJ1株，XBY01株，16M株，08M株，HB0801-P180，150，115 株，NM2012 株，CQ-W70株）相似性为95.4%，说明该基因在大部分地方株亲缘接近，说明该基因普遍存在，可以应用于蛋白的血清学检测提供基础。牛支原体武威株deoC基因不存在终止密码子，故设计一对特异性引物完成引物扩增，为方便后续实验中蛋白的纯化，载体选用HIS标签的pET-28a（+）载体来完成基因的表达，表达后经过分析得该蛋白为可溶性表达，大小约为24.2 ku，将重组蛋白进行多次点射免疫新西兰兔得到对抗血清，Western blot 结果显示：重组蛋白deoC抗血清有良好的免疫原性。本研究中，deoC基因具有良好的免疫原性，初步认定可以作为牛支原体疾病早期诊断靶抗原，为治疗筛选抗原库提供依据。图16牛支原体deoC蛋白的三级结构预测模型拉曼图分析Figure 16Raman diagram analysis of three-stage structure prediction model of mycoplasma bovis deoC protein图15牛支原体deoC蛋白的三级结构预测Figure 15tertiary structure prediction of mycoplasma bovis deoC protein30第 3 期蔡伟等：牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析二级结构主要是以a-螺旋和不规则卷曲存在（-螺旋包含 46.85%，16.67%的 e-延伸链、7.21%的折叠（S）、和29.28%的无规则卷曲（L）其中a-螺旋键能存在于蛋白的二级结构，主要作用是蛋白结构的骨架作用，此外-折叠和无规则卷曲更灵活的使蛋白结构发生变形，更加利于发生答应，例如暴露更多结合位点使之结合。预测蛋白三级结构与模板相似性为50.92%，另外对模板进一步进行拉曼图分析，结果表明该模型可信度高。本研究显示：预测蛋白存在19 个潜在的磷酸化位点和1 个糖基化位点，表明该蛋白可能参加生物酶活性激活从而参与信号传导与致病机理有着潜在的研究价值。通过对deoC的亚细胞定位实验得知，在牛支原体细胞膜稍微低于细胞膜，在细胞质和细胞膜上均有分布。研究已经证明该蛋白具有好的免疫原性，但是具体作用机制尚不明确，以及具体过程待进一步研究。对deoC蛋白的理化性质预测：该蛋白属于复合型蛋白，一种偏酸性蛋白（pI理论值为6.45）、稳定的亲水性蛋白。蛋白分子蛋白分子大小约为24.2 ku、分子式C1074H1746N276O331S13、其中酪氨酸最多（12.2%）、该蛋白体外培养半衰期约为30 h，不存在信号肽序列，不稳定指数是23.42，以上信息都说明该蛋白属于稳定蛋白且不具有信号肽。4结论对牛支原体 deoC 基因纯化表达后获得大小约为24.2 kU的纯化蛋白且具有良好免疫原性，证明蛋白主要分布在牛支原体膜，并通过同源性分析得知该基因序列高度保守，与国内分离株序列同源性为95.4%，具有遗传稳定性，同时获得高效的可溶性重组蛋白，大小约为24.2 kU，融合蛋白免疫新西兰兔，Western blot 结果显示：重组蛋白deoC抗血清与牛支原体全能发生特异性结合。间接ELISA结果表明，deoC蛋白在牛支原体膜上和细胞质中均有分布，且在细胞质中的分布多于在细胞膜，为牛支原体膜相关蛋白。deoC蛋白的生物学信息研究表明：其编码的蛋白不存在存在信号肽和跨膜结构.有19 个潜在的磷酸化位点和 1 个糖基化位点.蛋白大小为24.2 kU，由222 个氨基酸（酪氨酸最多12.2%）组成的亲水性蛋白，二级结构是复合型结构组成，并且成功的预测了该蛋白的三级结构和进行拉曼图分析，结果成立。参考文献1 王天宇，李继东，张志诚，等.牛支原体病流行病学及其诊断技术研究进展 J.畜牧与兽医，2021，53（12）：134-139.2 耿长国，刘沙，罗恺，等.牛支原体肺炎诊治 J.四川畜牧兽医，2013，40（12）：55.3 张锐，杨铭伟，任静静，等.牛支原体新疆分离株 P48 基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究 J.中国畜牧兽医，2018，45（7）：1949-1957.4 凌晨，郝成武，何海，等.牛支原体新疆株的分离鉴定J.中国畜牧兽医，2019，46（5）：1466-1473.5 张轩，储岳峰，逯忠新.家畜重要支原体病疫苗的研究进展 J.中国兽医科学，2011，41（12）：1314-1320.6 Galn A G，Seva J，Martn G，et al.Importance and antimicrobial resistance of mycoplasma bovis in clinical respiratory disease in feedlot calves J.Animals，2021，11（5）.1470.7 李利宏.Pseudomonas Putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及手性合成 D.无锡：江南大学，2019.8 刘松，聂挺，陆豫，等.2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达 J.南昌大学学报（理科版），2014，38（1）：74-78.9 毛芳芳.羰基还原酶不对称还原6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的研究 D.杭州：浙江工业大学，2012.10 蒋仁新，王基隆，朱曼玲等.一种新的牛支原体膜蛋白 p59 的表达与鉴定 J.中国病原生物学杂志，2019，14（11）：8.11 赵洪波，任建林.醛缩酶与肝癌的关系 J.中国医药指南，2010，8（36）：211-213.12 梁兴国，李佥，黄丽丽等.核酸代谢与营养研究及发展趋势 J.中国海洋大学学报（自然科学版），2019，49（10）：64-78.13 Han T K，Zhu Z，Dao M L.Identification，molecular cloning，and sequence analysis of a deoxyribosed aldolase in Streptococcus mutans GS-5J.Current microbiology，2004，48（3）：230-236.14 Kim Y M，Chang Y H，Choi N S，et al.Cloning，expression，and characterization of a new deoxyribose 5-phosphate aldolase from Yersinia sp.EA015 J.Protein Expr Purif，2009，68（2）：196-200.15 李令臣，吴胜昔，梁望旺，等.牛支原体P33蛋白的原核表达及鉴定J.黑龙江畜牧兽医，2019（7）：31甘肃农业大学学报2023 年81-84.16 包世俊，冯娜，邢小勇，等.牛支原体武威分离株丙酮酸激酶基因的原核表达及其表达产物的功能检测J.中国预防兽医学报，2020，42（4）：341-346.17 胡国明，邢小勇，李娜，等.牛支原体武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表达及亚细胞定位 J.甘肃农业大学学报，2016，51（2）：1-7.18 Salleron L，Magistrelli G，Mary C，et al.DERA is the hu