黄芩、苍术对湿阻中焦证大鼠燥湿作用的性效关系.pdf
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1、Doi:10.12054942.2023.02.007Jun.2023JournalofHainalormaScience2023年6 月Vol.36 No.2第36 卷第2 期海南师范日然科学版)黄芩、苍术对湿阻中焦大鼠燥湿作用的性效关系胡小勤1.2 3,陶美霖,曾雪霞,付蓉,蒙丹1,曾学文1,3*(1.广西中医药大学药学院,广西南宁530022;2.广西中药药效研究重点实验室,广西商南宁530022;3.金华高等研究院中医康复研究所,浙江金华321013)摘要:为了观察黄芩和苍术对湿阻中焦证证候模型燥湿功效的差异,阐明黄苓和苍术燥湿作用与药性组合的关联性,将6 4只雄性SD大鼠随机分为正常
2、组、模型组、黄苓高剂量组、黄苓中剂量组、黄苓低剂量组、苍术高剂量组、苍术中剂量组和苍术低剂量组。正常组常规喂养,其余各组通过饱时内服油脂、饥时灌胃冰水和外部寒湿环境作用2 0 d复制湿阻中焦证模型。采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠胃和结肠组织的病理学变化,采用胃液游离酸度测定方法检测胃液酸度,采用胃蛋白酶活性测定方法测定胃蛋白酶活力,使用蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测大鼠结肠组织水通道蛋白3(AQP3)表达情况。结果表明,与正常组比较,模型组大鼠宏观表征显示具有湿阻中焦证的表现,胃、结肠组织有炎症反应,胃液游离酸度降低(P0.05),胃蛋白酶活力减弱(P0.05);结肠组织中
3、AQP3蛋白表达量有所下降。与模型组比较,给药组大鼠宏观表征得到改善,黄苓和苍术对模型大鼠胃和结肠组织炎症都有一定的改善作用,苍术各剂量组均可升高模型大鼠胃液游离酸度(P0.05)和增强模型大鼠胃蛋白酶活力(P0.05),黄芩各剂量组也可升高模型大鼠胃液游离酸度和增强模型大鼠胃蛋白酶活力,但差异无统计学意义,黄苓中、低剂量组和苍术高、中、低剂量组均能显著降低结肠组织AQP3蛋白表达,研究证明黄苓和苍术对湿阻中焦证大鼠的燥湿作用与其药性组合具有一定的关联性,即其燥湿功效的强弱与其寒热药性有关,苦温的苍术比苦寒的黄苓作用效果更好。关键词:黄苓;苍术;湿阻中焦证;性效关系中图分类号:R285.5文献
4、标志码:A文章编号:16 7 4-4942(2 0 2 3)0 2-0 150-0 8The Nature-effect Relationship of Scutellaria baicalensis and RhizomaAtractylodis on Dryness-dampness in Rats with Middle Jiao SyndromeHU Xiaoqin1.2.3,TAO Meilin,ZENG Xuexia,FU Rong,MENG Dan,ZENG Xuewent.3(1.College of Medicine,Guangxi University of Chinese
5、 Medicine,Nanning 530022,China;2.Guangxi Key Laboratory of Pharmacodynamics of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530022,China;3.Institute of Traditional Chinese Medicine Rehabilitation,Jinhua Advanced Research Institute,Jinhua 321013,China)收稿日期:2 0 2 2-10-11基金项目:广西中医药大学2 0 18 年广西一流学科建设项目重点课题(2 0
6、18 XK041);广西中药药效研究重点实验室系统性研究课题(17-2 59-2 0-A7)第一作者:胡小勤(197 5一),安徽怀宁人,教授,研究方向为中药药性和药效关系。E-mail:*通信作者:曾学文(197 5一),江西赣州人,副教授,研究方向为统计学。E-mail:1590 7 8 137 18 16 3.c o m151第2 期胡小勤,等:黄芩、苍术对湿阻中焦证大鼠燥湿作用的性效关系Abstract:To observe the diference of dryness-dampness effect of Scutellaria baicalensis and Rhizoma A
7、tractylodis onthe model of syndrome of dampness hampering middle jiao,and to clarify the relationship between the dryness-dampnesseffect of them and the combination of medicinal properties.Sixty-four male SD rats were randomly classified into the nor-mal group,model group,Scutellaria baicalensis hig
8、h-,medium-,and low-dose groups,as well as Rhizoma Atractylodishigh-,medium-,and low-dose groups.The normal group was fed routinely,and the other groups were fed with fat duringsatiety,ice water during hunger and external cold and humid environment for 20 days to replicate the model of syndrome ofdam
9、pness hampering middle jiao.The macroscopic characterization of rats was observed,the pathological changes of stom-ach and colon were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining,the acidity of gastric juice was measured by free acidityof gastric juice,the activity of pepsin was determined by pepsin ac
10、tivity assay,and the expression of aquaporin 3(AQP3)inrat colon was detected by Western blotting(Western blot).The results showed that compared with the normal group,themacroscopic characterization of the model group showed that the rats in the model group had the syndrome of dampnesshampering middl
11、e jiao.There were inflammatory reactions in stomach and colon,the concentration of free acidity in gastricjuice decreased,the activity of pepsin decreased,and the expression of AQP3 protein in colon decreased.Compared withthe model group,the macroscopic characterization of rats in the treated group
12、was improved,and Scutellaria baicalensis andRhizoma Atractylodis could improve the inflammation of stomach and colon tissue of model rats to a certain extent.Atracty-lodes macrocephala could increase the concentration of free acidity of gastric juice(P0.05)and enhance the activity of pepsinin model
13、rats(P0.05).All dose groups of Scutellaria baicalensis could also increase the concentration of free acidity of gastricjuice and enhance the activity of pepsin in model rats,but the difference was not statistically significant.Scutellaria baicalen-sis medium and low dose groups and all dose groups o
14、f Rhizoma Atractylodis could significantly reduce the expression of AQP3protein in colon tissue of model group.Research showed that the dryness-dampness effect of Scutellaria baicalensis and Rhi-zoma Atractylodis macrocephala on rats with syndrome of dampness hampering middle jiao was related to the
15、ir combination ofmedicinal properties.Specifically,the efficacy of dryness-dampness was related to their cold/heat property,and the resultingoutcome of bitter-warm Rhizoma Atractylodis was better than that of bitter-cold Scutellariae baicalensis.Keywords:Scutellaria baicalensis;Rhizoma Atractylodis;
16、syndrome of dampness hampering middle jiao;nature-effectrelationship湿阻中焦证又称湿困脾胃证、湿困脾阳证,现代研究发现湿阻中焦是典型的中医证候,泛指湿邪困阻脾胃、阻遏气机所表现的证候。中医认为湿为阴邪,脾为阴土,喜燥恶湿,湿困脾胃,脾胃纳运失职,常表现为全身困重倦怠,胸闷,皖痞腹胀,食少纳呆,大便不爽,口黏苔腻等2 。黄芩,性寒,味苦,主要药效成分为黄酮类化合物,如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等3,具有安胎、止血、泻火解毒、清热燥湿的功效,常用于治疗暑湿、湿温、湿热痞满、胸闷呕恶等症。苍术,性温,味辛、苦,主要药用成分为
17、苍术素、苍术苷A、-桉叶醇、白术内酯I、白术内酯和白术内酯等4,具有明目、散寒祛风、健脾燥湿的功效,常用于治疗湿困脾胃、倦怠嗜卧、食欲不振、皖腹胀满、水肿等证。黄芩和苍术均具有燥湿的功效,但二者药性不同,它们在作用效果上也是不同的。本文通过观察比较苦-寒药性组合和苦-温药性组合分别作用于湿阻中焦证大鼠的疗效差异,探讨黄芩和苍术药性、证候、药效之间的内在联系,进一步阐释药性组合与药效的关联性,为药性与药效的研究奠定基础。1材料与仪器1.1 动物64只健康雄性SD大鼠,SPF级,体质量(2 0 0+2 0)g,由湖南斯莱克景实验动物有限公司提供,合格证号:SCXK(湘)2 0 16-0 0 0 2
18、1.2药物黄芩、苍术均购自南宁同仁堂大药房,经广西中医药大学中药鉴定教研室的滕建北教授鉴定,符合2 0 15年版中华人民共和国药典5规定色3011522023年海南师范大学学报(自然科学版)1.3试剂水合氯醛,成都市科隆化学品有限公司,批号2 0 18 0 416 0 1;4%多聚甲醛,上海Biosharp生物科技公司,批号18 0 92 0 9;苏木素,Bioswamp公司,批号为PAB180015;伊红试剂,Bioswamp公司,批号为PAB180016;氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术研究所,批号P0009。1.4仪器PAC3000型电泳仪,美国Bio-Rad
19、公司;MoticBA400型正置显微镜,德国徕卡显微系统有限公司;TFOB型人工恒温恒湿气候箱,上海程造仪器设备有限公司。2方法2.1药液制备取黄芩饮片,首次煎煮2 h(加12 倍量的水),第2 次煎煮1h(加8 倍量的水),把2 次药液合并后过滤,滤液水浴浓缩成含生药量为1g/mL的药液,备用。取苍术饮片,加8 倍量的水浸泡12 h后,首次煎煮2 h(加12 倍量的水),第2 次煎煮2 h(加8 倍量的水),把2 次药液合并后过滤,滤液水浴浓缩成含生药量为1g/mL的药液,备用。2.2动物分组、造模与给药雄性SD大鼠6 4只,随机分为8 组,每组8 只,即正常组、模型组、黄芩高剂量组、黄芩中
20、剂量组、黄芩低剂量组、苍术高剂量组、苍术中剂量组、苍术低剂量组。参照文献进行造模6-9,正常组常规喂养,其余各组每日控制大鼠睡眠时间8 h即向大鼠笼内加人4cm深的水,将其置于温度2 5、湿度95%的人工恒温恒湿气候箱内饲养,单日禁食且每只大鼠灌胃2 mL的4冰水,双日给予充足饲料且每只大鼠灌胃4mL的猪油,连续造模2 0 d。此后7 d,模型组和给药组大鼠于常温常湿度环境下饲养,黄芩高、中、低剂量组分别给予2.10、1.05、0.53g/k g 黄芩药液灌胃,苍术高、中、低剂量组分别给予1.8 9、0.95、0.47 g/kg苍术药液灌胃,正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水,给药容积为1mL/1
21、00g。给药剂量按照人与大鼠体表面积进行换算,其中,中剂量以成人临床常用的1d用量计算,低剂量和高剂量分别为中剂量的0.5倍和2 倍。2.3取材末次给药后,禁食不禁水12 h,麻醉,打开腹腔,在贯门和幽门处结扎,摘取全胃,清洗表面血污,并用滤纸干燥水分。在培养皿内,先用针管吸取胃液转入5mL试管中并观测其体积,再沿胃小弯处展开,用1mL蒸馏水浸洗胃壁,将浸洗液吸人同一试管内,最后用蒸馏水补足5mL,-2 0 冷冻储存;取距盲肠端6 至14cm的结肠段,用4生理盐水洗净后用滤纸吸干,平铺,纵向截取部分结肠。2.4指标测定2.4.1大鼠的宏观表征观察并记录大鼠的皮毛色泽、大小便性状、精神状态及活动
22、度等。分别于造模前、造模第10 天、造模第20天及给药结束后测定大鼠体重。2.4.2HE染色用4%多聚甲醛固定胃体和结肠,经过梯度酒精脱水、石蜡包埋,按厚度为4um切片,苏木素-伊红染光镜下观察胃组织和结肠组织的形态和病理改变2.4.3胃液游离酸度测定取每只大鼠稀释胃液各1ml,以酚酞为指示剂,用0.0 1mol/L的NaOH溶液滴定(溶液变为红色且2 s内不褪色即为滴定终点),记录消耗的NaOH体积()并计算胃液游离酸度=x0.01/0.0510。2.4.4胃蛋白酶活性测定取每只大鼠稀释胃液2 0 0 uL置于EP管中,严格按照胃蛋白酶试剂盒步骤操作,在6 6 0 nm处测定吸光度,计算每毫
23、升胃液在37 每分钟分解蛋白生成1ug氨基酸的酶量,即1个酶活力单位。胃蛋白酶活力计算公式:标准品浓度(50 g/mL)(测定OD值-对照OD值)-(标准OD值-空白OD值)反应液总体积(0.64mL)-取样量(0.0 4mL)-反应时间(10 min)。153胡小勤,等:黄芩、苍术对湿阻中焦证大鼠燥湿作用的性效关系第2 期2.4.5蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测大鼠结肠组织中AQP3蛋白的表达取结肠组织匀浆后,按照试剂盒说明提取结肠蛋白,取上清液,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。上样后进行电泳、转膜,封闭1.5h,加入AQP3一抗(1:10 0 0),4孵育过夜,TBST洗膜,加人
24、相应的二抗(1:40 0 0 0),37摇床孵育1.5h。洗膜3次后使用ECL法显色,用ImageJ软件分析条带的灰度值,以GAPDH为内参,以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值比作为最终结果。2.5统计学处理采用SPSS22.0进行统计处理,所有数据采用均数+标准差(xs)表示。采用单因素方差分析组间差异,两两比较采用LSD法检验。以P0.05表示有统计学差异3结果3.1大鼠宏观表征的变化正常组的大鼠体重逐日递增,涨势前期明显,后期逐渐趋于平缓,活动正常,食欲良好,背毛光泽,大便正常,反应灵活,小便淡黄;模型组的大鼠造模第10 天体重显著下降,造模后期体重稍有增长但仍比造模前低;造模期
25、间,大鼠倦怠懒动,喜蜷缩成堆,毛发晦暗无光泽,出现阴囊松驰下垂,饮食饮水量减少,大便稀,小便清;黄芩组与苍术组大鼠造模期间,症状和体征变化同模型组相似,给药第7 天,体重缓慢上升,饮食饮水量增加,精神状态有所好转3.2大鼠造模及给药后体质量的变化与正常组比较,造模前期各组大鼠体重差异不大,造模中后期正常组体重保持上升。由于造模期间对模型组和给药组采取相同的干预措施,所以与正常组比较,造模10 d和2 0 d后,模型组和给药组大鼠的体重均明显下降(P0.01)。给药7 d后,与空白组比较,模型组体重下降;与模型组比较,黄芩高、中、低剂量组和苍术高、中、低剂量组大鼠的体重均明显升高(P0.01)。
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