除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析.pdf
《除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析.pdf(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 .():/.:./.周黎 李伽文 徐郅卓 等.除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析.广西植物():.():.除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析周 黎 李伽文 徐郅卓 曾 拓 王彩云(.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 武汉 .贵州师范大学 生命科学学院贵阳 )摘 要:天然除虫菊酯是从除虫菊()中提取的绿色植物源生物杀虫剂 醛脱氢酶()和 脂肪酶()是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶 为探究 和 基因的功能该研究从除虫菊无性系中克隆得到 和 基因的启动子并通过生物信息学分析、组织化学染色(染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异
2、性和组织特异性进行分析 结果表明:()克隆得到的 和 启动子序列分别为 、均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件()分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体在烟草叶片中观察荧光成像发现 启动子具有茉莉酸甲酯()和脱落酸()激素诱导特异性()用 和 处理除虫菊组培苗发现 的表达量在 内受 诱导时上调受 诱导时先升高后降低 的表达量受 和 诱导下调()分别构建了 和 启动子与 基因融合的植物表达载体转化烟草并对其转基因叶片进行 活性染色发现 启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达而 启动子仅在烟草叶肉细胞中表达 综上认为 和 的启动子具有组织特异性 启动子具有 和 激素诱导特
3、性 该研究结果为除虫菊 和 基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解关键词:除虫菊 醛脱氢酶()脂肪酶()启动子 功能分析中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.().)收稿日期:基金项目:国家重点研发项目()中央高校基础研究基金()国家自然科学基金()第一作者:周黎()硕士研究方向为观赏植物生理与调控().通信作者:王彩云博士教授研究方向为花卉生理与品质及其花卉应用().:().()().().:().()().()().().().:除虫菊()作为一种多年生菊科植物几个世纪以来一直被用于提取绿色植物源杀虫剂除虫菊酯(.)其因提取于花头的除虫菊酯具有杀虫迅速、无富集易降解、对哺乳动物毒性
4、小、适用于敏感人群等特性被广 泛 应 用 于 有 机 农 业 和 家 居 防 治()其花头还能够释放大量挥发性萜烯()法尼烯()b 能够在田间吸引瓢虫驱避蚜虫(.)同时吸引大量授粉昆虫如食蚜蝇等(.曾拓等)因此除虫菊也作为一种间作作物在我国云南有广泛的应用(周黎等)全世界对除虫菊酯的需求较大将其作为天然植物源杀虫剂以避免过度使用化学合成杀虫剂(.)因此如何提高除虫菊酯的含量一直是除虫菊产业和基础研究的热点和重点除虫菊酯在植物体内由单萜羧基部分(菊酸和除虫菊酸)和酮醇部分(除虫菊酮醇、茉莉酮醇和瓜 叶 酮 醇)酯 化 形 成(.)酸前体来源于萜烯途径的质体甲基赤藓醇 磷酸()途径(.)酮醇前体来
5、源于茉莉酸类激素()途径(.)在除虫菊酯单萜合成模型中两分子二甲基烯丙基二磷酸()首先在腺体中依次由菊基二磷酸合成酶()、乙 醇 脱 氢 酶 ()、醛 脱 氢 酶 ()催化形成前体分子菊酸随后菊酸被运输到腺体下方的皮下组织最终在种子和果皮中被 脂肪酶()催化形成除虫菊酯后被胚胎吸收转移至幼苗组织中(.)参与除虫菊酸部分最后一步催化反应合成菊酸 菊酸 和酮醇则在 的催化 期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析作用下通过酯键相连合成最终产物除虫菊酯(.)由此可知 和 是除虫菊酯合成的关键限速酶基因 目前已经从拟南芥和棉花中克隆到大量 和 基因的启动子(.)此外高粱、大豆以及黄花蒿等物种中也
6、报道了 基因的启动子 然而从除虫菊中仅分离出一个具有腺体特异表达的菊基二磷酸合成酶基因 的启动子(.)因此研究其他除虫菊酯合成酶基因的启动子是解析除虫菊酯合成调控机制的前提茉莉酸及其衍生物不仅作为反应底物参与除虫菊酯酮醇部分的生物合成同时作为防御应激类激素调控除虫菊酯的合成(.)课题组前期进行了茉莉酸甲酯处理下的白花除虫菊叶片和花期转录组数据分析注释到了很多与除虫菊酯合成代谢相关的基因 基于此本研究通过除虫菊无性系 克隆得到 和 基因的启动子序列对其调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行了分析进一步揭示除虫菊酯的合成机制及代谢调控中植物激素的作用从而为培育除虫菊优良品种和提高除虫
7、菊酯含量提供理论依据材料与方法.实验材料除虫菊无性系的叶片取自华中农业大学组培室 大肠杆菌 和根癌农杆菌、购自上海唯地生物技术有限公司 用于转化的本氏烟草()在 、光照/黑暗条件的组培室中生长.启动子克隆利用 (美基生物 中国)提取除虫菊叶片的 作为模板依据除虫菊基因组(.)设计 基因启动子的特异引物 及 下游(表)基因启动子的特异引物 及 下游(表)利用 高 保 真 酶 ()进行扩增将扩增产物连接到 载体()转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序 利用除虫菊基因组对获得的片段进行检验 利用 软件对启动子的元件进行预测.载体构建以测序正确的质粒为模板分别利用含有同源重 组 片 段 的 引 物、(表)进
8、行扩增 回收 产物连接到经 酶切的 载体上转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序选取测序正确的载体转化 农杆菌以测序正确的质粒为模板分别利用含有同源重组片段的引物、(表)进 行 扩 增 回 收 产物连接到经 和 酶切的 载体上转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序选取测序正确的载体转化 农杆菌.烟草中 瞬时表达和荧光成像将含有重组 载体的农杆菌单菌落接种到发根农杆菌培养基()中培养至.离心 后用 侵染液重悬调节至 .选取生长 至 周的本氏烟草用无针头的注射器将农杆菌菌液注射到烟草叶片叶片左半部分注射含有空载 载体的农杆菌右半部分注射含有重组 载体的农杆菌 注射后的烟草置于人工气候室中培养 后在烟草叶片上喷施
9、的脱落酸()浓度参考胡慧敏等()的方法或喷施 的茉莉酸甲酯()浓度参考陈雨倩等()的方法以喷施清水植株的叶片作为对照 放 置 后 将 试 剂 盒 中 的 与 混合涂抹在烟草的注射区然后使用 (德国)仪器观察荧光.不同激素处理下除虫菊 和 基因表达分析 处 理:以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊 无 性 系 作 为 实 验 材 料 使 用 的 的 溶液喷施处理组培苗浓度参考()拧紧瓶盖培养、后将实验材料叶片放置在液氮中迅速冷却后保存于 冰箱广 西 植 物 卷 处 理:以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊 无 性 系 作 为 实 验 材 料 使 用 的 的 溶液喷施处理组培苗
10、拧紧瓶盖培养、后将实验材料叶片放置在液氮中迅速冷却后保存于 冰箱利用 分析两种激素处理后的基因表达水平 提取使用植物 提取试剂盒 (康为世纪生物科技有限公司)反转录形成 使用 (北京全式金生物技术有限公司)进行荧光定量分析荧 光 定 量 的 仪 器 为 试剂为 (北京艾德莱生物科技有限公司)荧光定量使用的引物为、和 (表)(.).烟草遗传转化筛选及 表达将含有 质粒的农杆菌单菌落接种到 液体培养基中培养至 .离心 后用液体 ()基本培养基重悬调节至 .将烟草叶片切成.放入农杆菌菌液侵染 后在滤纸上晾干将侵染后的烟草叶片转移至共培养培养基上培养基配方为 基本培养基.苄氨基嘌呤().萘乙酸()黑暗
11、条件下培养 后将叶片转移至筛选培养基培养基配方为 基本培养基.头孢霉素()卡那霉素()每 周继代一次当抗性芽生长至 时将抗性芽切下放置在含有 和 的 培养基中继续培养提取卡纳霉素抗性本氏烟草叶片的 以其为模板用 作为上游 启动子 特 异 引 物 作 为 下 游 检 验 转基因烟草用 作为上游 作为下游检验 转基因烟草转化所用菌株为阳性对照野生烟草为阴性对照 植物 提取试剂盒为 (美基生物中国)扩增 为 (近岸蛋白质科技有限公司中国)表 实验所用引物 引物序列 到(从左到右)()将继代培养一个月的阳性烟草用 (中国)进行染色实验步骤参照试剂盒说明书染色后用 的酒精脱色至叶片完全褪绿后在体视显微镜
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 除虫菊 TcALDH TcGLIP 基因 启动子 克隆 功能分析
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。