20%28S%29-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制.pdf
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1、第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.4Jul.2023DOI:10.13481/j.1671587X.2023040620(S)-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制张好1,王翠竹2,皇甫慧敏1,张新威1,张一迪1,周延民1(1.吉林大学口腔医院种植科,吉林 长春 130021;2.吉林大学药学院药物设计学教研室,吉林 长春 130021)摘要 目的目的:探讨 20(S)-原人参二醇(PPD)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作
2、用,并阐明其成骨诱导机制。方法方法:采用全骨髓法提取 SD 大鼠 BMSCs,分为对照组和不同剂量(2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0 mg L1)PPD 组,采用 CCK-8 法检测各组 BMSCs 增殖活性,采用Calcein/PI染色法观察各组 BMSCs存活情况,筛选合适浓度 PPD 用于后续实验。将 BMSCs分为对照组和 PPD 组,于成骨诱导第 7 天,采用 BCIP/NBT 比色法进行碱性磷酸酶(ALP)染色并定量检测各组 BMSCs中 ALP 活性;成骨诱导第 21天,采用茜素红染色检测各组 BMSCs中矿化结节形成情况并定量分析细胞矿化活性;成骨诱导第 7 天
3、,采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测各组BMSCs中 ALP、1型胶原蛋白(COL-1)、骨钙素(OCN)和 Runt相关转录因子 2(Runx-2)mRNA表达水平,免疫荧光染色法检测各组 BMSCs中 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度。结果结果:PPD 处理第 1和 3天,与对照组比较,40.0 mg L1 PPD组 BMSCs增殖活性明显降低(P0.05),20.0 和 40.0 mg L1 PPD 组 BMSCs 增殖活性明显降低(P0.01)。培养第 1 和 3 天,5.0、10.0和 20.0 mg L1 PPD 组活细胞数较多,故选用 10.0 mg L1
4、 PPD 用 于 后 续 实 验。成 骨 诱 导第 7天,与对照组比较,PPD 组 BMSCs的 ALP活性明显升高(P0.01);成骨诱导第 21天,与对照组比较,PPD 组 BMSCs 中矿化结节数明显增多,矿化活性明显升高(P0.01);成骨诱导第 7 天,与对照组比较,PPD 组 BMSCs 中 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2 mRNA 表达水平明显升高(P0.05),Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度均明显升高(P0.01)。结论结论:PPD 可通过增加 BMSCs ALP 活性和钙盐沉积,上调 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2 等成骨基因的表达进而
5、促进 BMSCs的成骨分化,PPD是一种有效的成骨诱导活性因子。关键词 20(S)-原人参二醇;成骨;骨髓间充质干细胞;细胞分化;碱性磷酸酶;免疫荧光染色中图分类号 R285.5;Q2-33 文献标志码 AEffect of 20(S)-protopanaxadiol on osteogensis differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats and its mechanism ZHANG Hao1,WANG Cuizhu2,HUANGFU Huimin1,ZHANG Xinwei1,ZHANG Yidi1,ZHOU
6、 Yanmin1(1.Department of Plantation,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Department of Pharmaceutical Design,School of Pharmaceutical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China)文章编号 1671587X(2023)04086708收稿日期 20221011基金项目 国家自然科学基金项目(82071152)作者简介 张 好(1992),女,山东省济南市人,在
7、读硕士研究生,主要从事干细胞和组织再生方面的研究。通信作者 周延民,教授,主任医师,博士研究生导师(E-mail:)867第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报(医学版)ABSTRACT Objective:To discuss the effect of 20(S)-protopanaxadiol(PPD)on the osteogensis differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)of the rats,and to clarify the osteogenesis induction me
8、chanism.Methods:The BMSCs were extracted from the SD rats by whole bone marrow method,and the BMSCs were divided into control group and 2.5,5.0,10.0,20.0,and 40.0 mg L1 PPD groups;CCK-8 assay was used to detect the proliferation activities of BMSCs in various groups;the survival of BMSCs in various
9、groups was observed by Calcein/PI staining;the suitable concentration of PPD for the subsequent experiments was selected.The BMSCs were divided into control group and PPD group.On the 7th day of osteogenesis induction,BCIP/NBT colorimetry was used to carry out alkaline phosphatase(ALP)staining and q
10、uantitatively detect the activities of ALP in the BMSCs in various groups;On the 21th day of osteogenesis induction,the formations of calcium nodules in the BMSCs in various groups were detected by Alizarin red staining and the mineralization activities of cells in various groups were quantitatively
11、 detected;On the 7th day of osteogenesis induction,real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR)method was used to detect the expression levels of ALP runt-related transcription factor 2(Runx-2),type collagen(COL-1),and osteocalcin(OCN)mRNA in cells in various groups;the immunofluorescence intens
12、ities of Runx-2 and OCN protein expressions in the BMSCs in various groups were measured by immunofluorescence staining.Results:On the 1st and 3rd days of PPD treatment,compared with control group,the proliferation activity of the BMSCs in 40.0 mg L1PPD group was significantly decreased(P0.05),the p
13、roliferation activities of the BMSCs in 20.0 and 40.0 mg L1 PPD groups were significantly decreased(P0.01).On the 1st and 3rd days of osteogensis induction,the numbers of alive cells in 5.0,10.0,and 20.0 mg L1 PPD groups were more,so 10.0 mg L1 PPD was selected to use for the following experiment.On
14、 the 7th day of osteogenesis induction,compared with control group,the activity of ALP in the cells in PPD group was significantly increased(P0.01);on the 21st day of osteogenesis induction,compared with control group,the number of mineralized nodules in the cells in PPD group was significantly incr
15、eased,and the minealized activity was increased(P0.01);on the 7th day of osteogenesis induction,compared with control group,the expression levels of ALP,COL-1,OCN,and Runx-2 mRNA in the cells in PPD group were significantly increased(P0.05),the fluorescence intensities of expressions of Runx-2 and O
16、CN proteins in the cells in PPD group were significantly increased(P0.01).Conclusion:PPD can promote the osteogenic induction of the BMSCs by increasing the ALP activity and calcium salt deposition in the BMSCs and increasing the expressions of osteogenic genes such as ALP,COL-1,OCN and Runx-2,and P
17、PD is an effective osteogenesis induction activity factor.KEYWORDS 20(S)-protopanaxadiol;Osteogenesis;Bone marrow mesenchymal stem cells;Cell differentiation;Alkaline phosphatase;Immunofluorescence staining骨 髓 间 充 质 干 细 胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新和多向分化潜能1,可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,被认
18、为是骨组织工程的种子细胞2,可用于治疗骨缺损。为了提高患者的成骨效率,刺激 BMSCs 向成骨细胞分化至关重要。研究3-4显示:一些中药对 BMSCs 具有成骨诱导作用,可用于治疗骨缺损。人参是一种多年生草本植物,含有多种活性成分,主要活性成分为人参皂苷5。人参皂苷连接不同的苷元,分为齐墩果烷和达玛烷两大类,其中后者包括 20(S)-原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)和 20(S)-原 人 参 三 醇(protopanaxatriol,PPT)6。PPD 是 人 参 皂 苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rh2 和 Rg3 等 的 最 终 代 谢 物,大量的研究7-12表明:PPD
19、具有多种生物活性,包括抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗炎和抗抑郁等。血管生成不足可导致骨缺损部位的微环境不利于成骨13。研究14表明:PPD 可通过磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyinositol-3 kinase,PI3K)/蛋 白 激酶 B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素868张好,等.20(S)原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和 丝/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶(serine/threonine-protein kinase,Raf)/细 胞 外 信 号 调
20、 节 蛋 白 激 酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路促进血管生成,有助于运输氧气和营养物质及排出代谢产物,参与骨再生的生物学过程,但目前PPD 对 BMSCs是否具有成骨分化作用尚未见相关报道。本研究通过观察 PPD 对 BMSCs增殖和分化的影响,探讨 PPD 是否可促进 BMSCs定向成骨分化,旨在明确 PPD 作为一种良好的成骨诱导因子的可能性。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器出生后 7 d的雄性 SD 大鼠 5 只,购于长春市亿斯实验动物技术 有 限 责 任 公 司,动 物 生
21、产 许 可 证 号:SCXK(吉)2020-0002。-MEM 培养基(美国 Hyclone公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美国Clark 公司),PPD(分子式为 C30H52O3,相对分子质量为 460.4,由吉林大学药学院提供),RNA 逆转 录 试 剂 盒 和 实 时 荧 光 定 量 PCR(real-time fluorescence qualitative PCR,RT-qPCR)检 测 试剂盒 翌圣生物科技(上海)股份有限公司,PCR 引物购于生工生物工程(上海)有限公司,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和茜素红染色液
22、(北京索莱宝科技有限公司),TRIzol 裂解液(日本 TaKaRa 公司),CCK-8 检测试剂盒、Calcein/PI 细 胞 活 性 与 毒 性 检 测 试 剂 盒、BCIP/NBT 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色试剂盒、ALP 检测试剂盒、增强型 BCA 蛋白试剂 盒、Runt 相 关 转 录 因 子 2(runt-related transcription factor 2,Runx-2)兔单克隆抗体、骨钙素(osteocalcin,OCN)兔多克隆抗体、Alexa Fluor 488 标 记 山 羊 抗 兔 IgG(H+L)和 Alexa Flu
23、or 647标记山羊抗兔 IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司)。Synergy HT 多功能酶标仪(美国 BioTek 公司),RT-qPCR 仪(美国 Bio-Rad公司),激光共聚焦显微镜(日本 Olympus公司)。1.2大鼠大鼠 BMSCs 分 离 和 培 养分 离 和 培 养 根 据 参 考 文献 15 中的方法提取 BMSCs。将出生 7 d左右的雄性 SD 大鼠深度麻醉处死后,使用无菌器械分离大鼠双侧股骨和胫骨。用无菌注射器吸取含 10%体积分数胎牛血清的-MEM 培养基对股骨和胫骨的骨髓腔反复冲洗,得到单细胞悬液,收集至离心管中,1 000 r min1 离心 5 m
24、in,弃上清后重悬,转移至培养皿中,置于 37、5%体积分数的 CO2培养箱中培养。培养 3 d 后更换新鲜-MEM 培养基,去除未贴壁细胞,待细胞长满 80%90%时首次传代,培养至第 3代用于后续实验。1.3CCK-8法检测各组法检测各组BMSCs增殖活性增殖活性将5 mg PPD 粉末溶解于 5 L DMSO 中,采用-MEM 培养基稀释为 1 g L1。实验组 BMSCs分别加入 2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0 mg L1 PPD 进 行 处 理,对照组 BMSCs不加 PPD。取第 3代 BMSCs,计数后以每孔 5103个细胞的密度接种于 96 孔细胞培养板中,按
25、照上述分组方法分别处理 1、3 和 7 d。培养至规定时间后每孔加入110 L配制好的CCK-8溶液(CCK-8溶液完全培养基=110),放入细胞培养箱中继续培养 30 min,采用酶标仪在 450 nm波长处检测吸光度(A)值,以 A 值的平均值表示BMSCs 增殖活性。根据药物毒性筛选出合适浓度的 PPD进行后续实验。每组进行 3次重复实验。1.4Calcein/PI染色法观察各组染色法观察各组 BMSCs存活情况存活情况 不同浓度 PPD组BMSCs分别加入5、10、20和40 mg L1 PPD 处理,对照组 BMSCs 不加 PPD。取第 3 代 BMSCs,计数后以每孔 2104个
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