20%28S%29-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制.pdf

第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671587X.2023040620（S）-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制张好1,王翠竹2,皇甫慧敏1,张新威1,张一迪1,周延民1（1.吉林大学口腔医院种植科，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院药物设计学教研室，吉林 长春 130021）摘要 目的目的：探讨 20（S）-原人参二醇（PPD）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的作用，并阐明其成骨诱导机制。方法方法：采用全骨髓法提取 SD 大鼠 BMSCs，分为对照组和不同剂量（2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0 mg L1）PPD 组，采用 CCK-8 法检测各组 BMSCs 增殖活性，采用Calcein/PI染色法观察各组 BMSCs存活情况，筛选合适浓度 PPD 用于后续实验。将 BMSCs分为对照组和 PPD 组，于成骨诱导第 7 天，采用 BCIP/NBT 比色法进行碱性磷酸酶（ALP）染色并定量检测各组 BMSCs中 ALP 活性；成骨诱导第 21天，采用茜素红染色检测各组 BMSCs中矿化结节形成情况并定量分析细胞矿化活性；成骨诱导第 7 天，采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测各组BMSCs中 ALP、1型胶原蛋白（COL-1）、骨钙素（OCN）和 Runt相关转录因子 2（Runx-2）mRNA表达水平，免疫荧光染色法检测各组 BMSCs中 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度。结果结果：PPD 处理第 1和 3天，与对照组比较，40.0 mg L1 PPD组 BMSCs增殖活性明显降低（P0.05），20.0 和 40.0 mg L1 PPD 组 BMSCs 增殖活性明显降低（P0.01）。培养第 1 和 3 天，5.0、10.0和 20.0 mg L1 PPD 组活细胞数较多，故选用 10.0 mg L1 PPD 用 于 后 续 实 验。成 骨 诱 导第 7天，与对照组比较，PPD 组 BMSCs的 ALP活性明显升高（P0.01）；成骨诱导第 21天，与对照组比较，PPD 组 BMSCs 中矿化结节数明显增多，矿化活性明显升高（P0.01）；成骨诱导第 7 天，与对照组比较，PPD 组 BMSCs 中 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2 mRNA 表达水平明显升高（P0.05），Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度均明显升高（P0.01）。结论结论：PPD 可通过增加 BMSCs ALP 活性和钙盐沉积，上调 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2 等成骨基因的表达进而促进 BMSCs的成骨分化，PPD是一种有效的成骨诱导活性因子。关键词 20（S）-原人参二醇；成骨；骨髓间充质干细胞；细胞分化；碱性磷酸酶；免疫荧光染色中图分类号 R285.5;Q2-33 文献标志码 AEffect of 20(S)-protopanaxadiol on osteogensis differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats and its mechanism ZHANG Hao1,WANG Cuizhu2,HUANGFU Huimin1,ZHANG Xinwei1,ZHANG Yidi1,ZHOU Yanmin1（1.Department of Plantation，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Pharmaceutical Design，School of Pharmaceutical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China）文章编号 1671587X(2023)04086708收稿日期 20221011基金项目 国家自然科学基金项目（82071152）作者简介 张 好（1992），女，山东省济南市人，在读硕士研究生，主要从事干细胞和组织再生方面的研究。通信作者 周延民，教授，主任医师，博士研究生导师（E-mail：）867第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）ABSTRACT Objective：To discuss the effect of 20（S）-protopanaxadiol（PPD）on the osteogensis differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）of the rats，and to clarify the osteogenesis induction mechanism.Methods：The BMSCs were extracted from the SD rats by whole bone marrow method，and the BMSCs were divided into control group and 2.5，5.0，10.0，20.0，and 40.0 mg L1 PPD groups；CCK-8 assay was used to detect the proliferation activities of BMSCs in various groups；the survival of BMSCs in various groups was observed by Calcein/PI staining；the suitable concentration of PPD for the subsequent experiments was selected.The BMSCs were divided into control group and PPD group.On the 7th day of osteogenesis induction，BCIP/NBT colorimetry was used to carry out alkaline phosphatase（ALP）staining and quantitatively detect the activities of ALP in the BMSCs in various groups；On the 21th day of osteogenesis induction，the formations of calcium nodules in the BMSCs in various groups were detected by Alizarin red staining and the mineralization activities of cells in various groups were quantitatively detected；On the 7th day of osteogenesis induction，real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method was used to detect the expression levels of ALP runt-related transcription factor 2（Runx-2），type collagen（COL-1），and osteocalcin（OCN）mRNA in cells in various groups；the immunofluorescence intensities of Runx-2 and OCN protein expressions in the BMSCs in various groups were measured by immunofluorescence staining.Results：On the 1st and 3rd days of PPD treatment，compared with control group，the proliferation activity of the BMSCs in 40.0 mg L1PPD group was significantly decreased（P0.05），the proliferation activities of the BMSCs in 20.0 and 40.0 mg L1 PPD groups were significantly decreased（P0.01）.On the 1st and 3rd days of osteogensis induction，the numbers of alive cells in 5.0，10.0，and 20.0 mg L1 PPD groups were more，so 10.0 mg L1 PPD was selected to use for the following experiment.On the 7th day of osteogenesis induction，compared with control group，the activity of ALP in the cells in PPD group was significantly increased（P0.01）；on the 21st day of osteogenesis induction，compared with control group，the number of mineralized nodules in the cells in PPD group was significantly increased，and the minealized activity was increased（P0.01）；on the 7th day of osteogenesis induction，compared with control group，the expression levels of ALP，COL-1，OCN，and Runx-2 mRNA in the cells in PPD group were significantly increased（P0.05），the fluorescence intensities of expressions of Runx-2 and OCN proteins in the cells in PPD group were significantly increased（P0.01）.Conclusion：PPD can promote the osteogenic induction of the BMSCs by increasing the ALP activity and calcium salt deposition in the BMSCs and increasing the expressions of osteogenic genes such as ALP，COL-1，OCN and Runx-2，and PPD is an effective osteogenesis induction activity factor.KEYWORDS 20（S）-protopanaxadiol；Osteogenesis；Bone marrow mesenchymal stem cells；Cell differentiation；Alkaline phosphatase；Immunofluorescence staining骨 髓 间 充 质 干 细 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有自我更新和多向分化潜能1，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，被认为是骨组织工程的种子细胞2，可用于治疗骨缺损。为了提高患者的成骨效率，刺激 BMSCs 向成骨细胞分化至关重要。研究3-4显示：一些中药对 BMSCs 具有成骨诱导作用，可用于治疗骨缺损。人参是一种多年生草本植物，含有多种活性成分，主要活性成分为人参皂苷5。人参皂苷连接不同的苷元，分为齐墩果烷和达玛烷两大类，其中后者包括 20（S）-原人参二醇（protopanaxadiol，PPD）和 20（S）-原 人 参 三 醇（protopanaxatriol，PPT）6。PPD 是 人 参 皂 苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rh2 和 Rg3 等 的 最 终 代 谢 物，大量的研究7-12表明：PPD具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗炎和抗抑郁等。血管生成不足可导致骨缺损部位的微环境不利于成骨13。研究14表明：PPD 可通过磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidyinositol-3 kinase，PI3K）/蛋 白 激酶 B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素868张好，等.20（S）原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和 丝/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶（serine/threonine-protein kinase，Raf）/细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路促进血管生成，有助于运输氧气和营养物质及排出代谢产物，参与骨再生的生物学过程，但目前PPD 对 BMSCs是否具有成骨分化作用尚未见相关报道。本研究通过观察 PPD 对 BMSCs增殖和分化的影响，探讨 PPD 是否可促进 BMSCs定向成骨分化，旨在明确 PPD 作为一种良好的成骨诱导因子的可能性。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器出生后 7 d的雄性 SD 大鼠 5 只，购于长春市亿斯实验动物技术 有 限 责 任 公 司，动 物 生 产 许 可 证 号：SCXK（吉）2020-0002。-MEM 培养基（美国 Hyclone公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Clark 公司），PPD（分子式为 C30H52O3，相对分子质量为 460.4，由吉林大学药学院提供），RNA 逆转 录 试 剂 盒 和 实 时 荧 光 定 量 PCR（real-time fluorescence qualitative PCR，RT-qPCR）检 测 试剂盒 翌圣生物科技（上海）股份有限公司，PCR 引物购于生工生物工程（上海）有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和茜素红染色液（北京索莱宝科技有限公司），TRIzol 裂解液（日本 TaKaRa 公司），CCK-8 检测试剂盒、Calcein/PI 细 胞 活 性 与 毒 性 检 测 试 剂 盒、BCIP/NBT 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）显色试剂盒、ALP 检测试剂盒、增强型 BCA 蛋白试剂 盒、Runt 相 关 转 录 因 子 2（runt-related transcription factor 2，Runx-2）兔单克隆抗体、骨钙素（osteocalcin，OCN）兔多克隆抗体、Alexa Fluor 488 标 记 山 羊 抗 兔 IgG（H+L）和 Alexa Fluor 647标记山羊抗兔 IgG（H+L）（上海碧云天生物技术有限公司）。Synergy HT 多功能酶标仪（美国 BioTek 公司），RT-qPCR 仪（美国 Bio-Rad公司），激光共聚焦显微镜（日本 Olympus公司）。1.2大鼠大鼠 BMSCs 分 离 和 培 养分 离 和 培 养 根 据 参 考 文献 15 中的方法提取 BMSCs。将出生 7 d左右的雄性 SD 大鼠深度麻醉处死后，使用无菌器械分离大鼠双侧股骨和胫骨。用无菌注射器吸取含 10%体积分数胎牛血清的-MEM 培养基对股骨和胫骨的骨髓腔反复冲洗，得到单细胞悬液，收集至离心管中，1 000 r min1 离心 5 min，弃上清后重悬，转移至培养皿中，置于 37、5%体积分数的 CO2培养箱中培养。培养 3 d 后更换新鲜-MEM 培养基，去除未贴壁细胞，待细胞长满 80%90%时首次传代，培养至第 3代用于后续实验。1.3CCK-8法检测各组法检测各组BMSCs增殖活性增殖活性将5 mg PPD 粉末溶解于 5 L DMSO 中，采用-MEM 培养基稀释为 1 g L1。实验组 BMSCs分别加入 2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0 mg L1 PPD 进 行 处 理，对照组 BMSCs不加 PPD。取第 3代 BMSCs，计数后以每孔 5103个细胞的密度接种于 96 孔细胞培养板中，按照上述分组方法分别处理 1、3 和 7 d。培养至规定时间后每孔加入110 L配制好的CCK-8溶液（CCK-8溶液完全培养基=110），放入细胞培养箱中继续培养 30 min，采用酶标仪在 450 nm波长处检测吸光度（A）值，以 A 值的平均值表示BMSCs 增殖活性。根据药物毒性筛选出合适浓度的 PPD进行后续实验。每组进行 3次重复实验。1.4Calcein/PI染色法观察各组染色法观察各组 BMSCs存活情况存活情况 不同浓度 PPD组BMSCs分别加入5、10、20和40 mg L1 PPD 处理，对照组 BMSCs 不加 PPD。取第 3 代 BMSCs，计数后以每孔 2104个细胞的密度接种于 24孔细胞培养板中，孵育 1 d后按照上述分组方法加入药物分别处理 1 和 3 d。培养至规定 时 间 后 加 入 配 制 好 的 Calcein 和 PI 染 色 液（CalceinPI检测缓冲液=111 000），在细胞培养箱中避光孵育 30 min，PBS 缓冲液冲洗后倒置荧光显微镜下观察结果并拍照，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。1.5 BMSCs 成 骨 分 化 诱 导 培 养成 骨 分 化 诱 导 培 养 将 第 3 代BMSCs 以每孔 4104个细胞的密度接种于 12 孔细胞培养板中，以每孔 7104个细胞的密度接种于6孔细胞培养板中，24 h后更换含或不含 PPD 的成骨诱导液。实验分 为 对 照 组（基 础 培 养 基+10 mmol L1-甘油磷酸钠+0.05 mmol L1 L-抗坏血酸-2-磷酸酯+100 nmol L1地塞米松）和 PPD组（基础培养基+10 mmol L1-甘油磷酸钠+0.05 mmolL 1 L-抗 坏 血 酸-2-磷 酸 酯+100 nmol L1地塞米松+10 mg L1 PPD），置于 37、5%CO2孵箱中培养，每隔 3 d换液 1 次。1.6BCIP/NBT 比色法观察各组比色法观察各组 BMSCs 中中 ALP染色情况和染色情况和 ALP活性检测活性检测成骨诱导第 7天，从培养箱中取出 12 孔细胞培养板，弃去旧培养基，869第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）PBS 缓冲液冲洗 3 次，室温下加入 4%多聚甲醛固定细胞 30 min，PBS缓冲液冲洗固定液后加入预先配制好的 BCIP/NBT 染色工作液进行 ALP 染色，光学显微镜观察实验结果并拍照。采用 Western 和IP 裂解液裂解细胞，离心后将细胞上清液收集至96 孔细胞培养板中，用ALP检测试剂盒检测 405 nm波长处 A 值，将 ALP 活性标准化为通过增强型BCA 蛋 白 试 剂 盒 测 定 的 细 胞 内 总 蛋 白（nmol min1mg1）。每组进行 3次重复实验。1.7茜素红染色检测各组茜素红染色检测各组 BMSCs 中矿化结节形中矿化结节形成情况和半定量分析成情况和半定量分析细胞矿化活性细胞矿化活性成骨诱导第21 天，从培养箱中取出 12 孔细胞培养板，弃去旧培养基，沿孔壁缓慢加入 PBS缓冲液清洗 3次，室温下加入 4%多聚甲醛固定细胞 15 min，PBS 缓冲液冲洗固定液，1%茜素红 染 色 液 室 温 下 染 色30 min后用 PBS缓冲液轻轻冲洗染色液，橘红色沉淀即为矿化结节，光学显微镜观察各组成骨细胞矿化结节形成情况。按照参考文献 16 中的方法，采用 10%十六 烷 基 氯 化 吡 啶 溶 解 钙 结 节 后 在562 nm 波长处检测 A 值，以 A 值表示细胞矿化活性。每组进行 3次重复实验。1.8RT-qPCR 法检测各组法检测各组 BMSCs中中 ALP、1 型胶型胶原蛋白原蛋白（type 1 collagen，COL-1）、）、OCN 和和 Runx-2 mRNA 表达水平表达水平成骨诱导培养第 7天，从培养箱中取出 6孔细胞培养板，弃去培养基，PBS 缓冲液洗涤 1次，每孔中加入 1 mL TRIzol提取总 RNA 并检测其浓度，以-actin为内参，采用反转录试剂盒将 RNA 逆转录成 cDNA，再以 cDNA 作为模板，使 用 SYBR Green qPCR Master Mix进 行RT-qPCR，检测各组细胞中ALP、COL-1、OCN 和Runx-2 mRNA 表达水平。引物序列：ALP，上游引 物 5-CATCGCCTATCAGCTAATGCACA-3，下 游 引 物 5-ATGAGGTCCAGGCCATCCAG-3；COL-1，上 游 引 物 5-GACATGTTCAGCTTT-GTGGACCTC-3，下 游 引 物 5-AGGGACCCTT-AGGCCATTGTGTA-3；OCN，上 游 引 物5-AAGCAGGAGGGCAATAAGGT-3，下游引物5-CCGTAGATGCGTTTGTAGGC-3；Runx-2，上 游 引 物 5-CATGGCCGGGAATGATGAG-3，下游引物 5-TGTGAAGACCGTTATGGTCAAA-GTG-3；-actin，上 游 引 物 5-GGAGATTACT-GCCCTGGCTCCTA-3，下 游 引 物 5-GACTC-ATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。采用 2Ct法计算各组 BMSCs中相关基因 mRNA 表达水平。每组进行 3次重复实验。1.9免疫荧光染色法检测各组免疫荧光染色法检测各组 BMSCs 中中 Runx-2和和 OCN 蛋白表达荧光强度蛋白表达荧光强度成骨诱导第 7 天，从培养箱中取出 12 孔细胞培养板，弃去旧培养基，PBS 缓 冲 液 冲 洗 3 次，固 定 和 封 闭 后 将 细 胞 与Runx-2 和 OCN 一抗 4 孵育过夜，用 PBS缓冲液 洗涤 3 次后分别与 Alexa Fluor 488标记抗兔二抗和Alexa Fluor 647 标记抗兔二抗孵育 1 h。采用罗丹明标记的鬼笔环肽和 DAPI染色，洗涤 3 次后用激光共聚焦扫描显微镜观察，采用Image J统计软件分析各组 BMSCs中 Runx-2和 OCN蛋白表达荧光强度。1.10统计学分析统计学分析采用 GraphPad Prism 9 统计软件进行统计学分析。各组 BMSCs 增殖活性、ALP活性和矿化活性，细胞中成骨相关因子 mRNA 表达水平及 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度，均符合正态分布，以 xs表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用Tukey检验。以 P0.05）；处理第 1 和 3 天，与对照组比较，40.0 mg L1 PPD 组 BMSCs 增殖活性明显降低（P0.01）；处 理 第 7 天，与 对 照 组 比 较，20.0 和 40.0 mg L1 PPD 组 BMSCs 增殖活性明显降低（P0.01）。见图 1。2.2各组各组 BMSCs存活情况存活情况在培养第 1 和 3 天时进 行 Calcein/PI 活 死 细 胞 染 色，除 40.0 mg L1 PPD 组外其余各组 BMSCs 中绿染的活细胞数较多，红染的死细胞数极少，而 40.0 mg L1 PPD 组BMSCs中绿染的活细胞较少。见图 2。基于上述实验结果，选用 10.0 mg L1 PPD用于后续实验。2.3 各 组各 组 BMSCs 的的 ALP 染 色 情 况 和染 色 情 况 和 ALP 活 性活 性 成骨诱导第 7 天，对照组 BMSCs 中可见较微弱的蓝色颗粒，PPD 组 BMSCs中可见明显的蓝紫色颗粒，且 PPD 组 BMSCs中蓝紫色颗粒明显多于对照组。见图 3。与对照组（1.900.15）nmol min1mg1 比 较，PPD 组 BMSCs 的 ALP 活 性 （2.790.11）nmol min1mg1明显升高（P0.01）。870张好，等.20（S）原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制2.4 各 组各 组 BMSCs 茜 素 红 染 色 情 况 和 矿 化 活 性茜 素 红 染 色 情 况 和 矿 化 活 性 成骨诱导第 21 天，2 组 BMSCs 中均可见橙红色矿化结节，与对照组比较，PPD 组 BMSCs中矿化结节数明显增多，染色面积明显增大且染色程度明 显 增 强。见 图 4。与 对 照 组（0.250.03）比较，PPD 组 BMSCs 矿化活性（0.620.04）明显升高（P0.01）。2.5 各 组各 组 BMSCs 中中 Runx-2、COL-1、ALP 和和OCN mRNA 表达水平表达水平与对照组比较，PPD 组BMSCs 中 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2 mRNA表达水平明显升高（P0.05）。见图 5。2.6各组各组 BMSCs中中 Runx-2和和 OCN 蛋白表达荧光蛋白表达荧光强度强度Runx-2 和 OCN 免疫荧光染色结果显示：与对照组比较，PPD 组 BMSCs 中 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度明显增强（图 6和 7）。定量分析结果 显 示：与 对 照 组（1.000.06 和 1.000.06）比较，PPD 组 BMSCs 中 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度（2.190.06 和 2.410.10）明显升高（P0.01）。*P0.01 compared with control group.图图 1各组各组 BMSCs增殖活性增殖活性Fig.1 Proliferation activities of BMSCs in various groups图图 2Calcein/PI染色观察各组染色观察各组 BMSCs存活情况存活情况（4）Fig.2Survival of BMSCs in various groups observed by Calcein/PI staining（4）A，B：Rresults of ALP staining under scanner；C，D：Results of ALP staining under microscope（4）；A，C：Control group；B，D：PPD group.图图 3成骨诱导第成骨诱导第 7天各组天各组 BMSCs的的 ALP染色情况染色情况Fig.3ALP staining of BMSCs in various groups after osteogensis induction for 7 d871第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）3 讨 论 严重创伤、感染、癌症和先天性畸形等均可导致骨组织的丧失，自体骨移植是骨移植重建的金标准。中草药可以促进成骨细胞增殖和抑制破骨细胞形成17-18，对骨形成具有积极作用，已被广泛用于骨组织工程中。PPD 可 促 进 血 管 内 皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，并在低浓 度（1 mol L1）时 促 进 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖14。本研究结果显示：低浓度 PPD 可以维持BMSCs 的活性，且不影响细胞增殖，但当浓度升高至 20.0 mg L1可明显抑制细胞增殖。PPD 对HUVECs和 BMSCs增殖活性影响不同，可能是因为不同细胞对药物的反应不同。A，B：Results of Alizarin red staining under scanner；C，D：Results of Alizarin red staining under microscope（4）；A，C：Control group；B，D：PPD group.图图 4各组各组 BMSCs中矿化结节形成情况中矿化结节形成情况Fig.4Formations of mineralized nodules in BMSCs in various groups*P0.05 vs control group.图图 5各组各组 BMSCs中成骨相关基因中成骨相关基因 mRNA表达水平表达水平Fig.5 Expression levels of osteogensis-related gene mRNA in BMSCs in various groups图图 6各组各组 BMSCs 中中 Runx-2免疫荧光染色情况免疫荧光染色情况（40）Fig.6Immunofluorescence staining of Runx-2 in BMSCs in various groups（40）872张好，等.20（S）原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制BMSCs 的成骨分化是骨再生的主要机制19。本研究采用全骨髓贴 壁 法 成 功 在 体 外 分 离 培 养SD 大鼠 BMSCs。成骨标志物包括 ALP、COL-1、OCN 和 Runx-2。ALP 是早期成骨细胞分化的标志物20，其表达水平和分泌量增加常伴随着成骨细胞分化的增加21，提示 ALP 在骨形成过程中起重要作用。COL-1是成骨细胞分泌的细胞外基质的主要成分之一，可为细胞外基质的成熟和钙化结节的发育提供结构框架22-23。本研究结果显示：PPD可促进 BMSCs中 COL-1的表达，且可促进矿化结节的形成，最终导致骨基质矿化。OCN 是骨基质的重要非胶原成分，仅由成骨细胞分泌24，主要产生于矿物质形成阶段（中晚期），参与骨矿化过程。Runx-2 属 于 Runt/核 心 结 合 因 子 （core-binding factor alpha，Cbfa）转录因子家族，可直接刺激BMSCs中与成骨分化相关的多种基因转录25，包括 OCN、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、COL-1和 Runx-2，其表达水平升高标志着成骨分化的开始。本研究结果显示：与对照组比较，PPD 可增强 BMSCs 的 ALP 活性，成骨诱导第 21 天 PPD 组BMSCs 中矿化结节增加；成骨诱导第 7 天，PPD激活 Runx-2 蛋白，进而诱导成骨标志物 OCN 和COL-1蛋白的表达，表明 PPD 对 BMSCs成骨分化具有刺激作用。另外，本研究中免疫荧光染色结果显示：PPD 组 BMSCs 中 Runx-2 和 OCN 蛋白表达荧光强度明显升高，表明 PPD 可能是成骨分化的潜在诱导剂。血 管 生 成 的 潜 在 机 制 在 于 VEGF 的 作 用，VEGF是一种有效的血管生成肽，对内皮细胞具有促 有 丝 分 裂 和 趋 化 作 用26。研 究27-28 表 明：VEGF 通 过 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因 子 受 体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）信号通路调节 ALP 和 OCN 的表达，直接作用于成骨细胞，从而促进骨重塑。因此 PPD的成骨作用也可能与 PPD 激活 VEGFR2 信号通路有关。综上所述，PPD 可通过提高成骨相关因子的表达进而促进 BMSCs 的成骨分化能力，本研究结果为骨组织工程中骨缺损修复提供了理论依据。参考文献1 XING X，HAN S，CHENG G，et al.Proteomic analysis of exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells：a novel therapeutic strategy for tissue injury J.Biomed Res Int，2020，2020：6094562.2 LIU C，SUN J.Impact of marine-based biomaterials on the immunoregulatory properties of bone marrow-derived mesenchymal stem cells：potential use of fish collagen in bone tissue engineering J.ACS Omega，2020，5（43）：28360-28368.3 YANG N，ZHANG X，LI L F，et al.Ginsenoside rc promotes bone formation in ovariectomy-induced osteoporosis in vivo and osteogenic differentiation in vitro J.Int J Mol Sci，2022，23（11）：6187.4 DING L L，GU S，ZHOU B Y，et al.Ginsenoside compound K enhances fracture healing via promoting 图图 7各组各组 BMSCs 中中 OCN免疫荧光染色情况免疫荧光染色情况（40）Fig.7Immunofluorescence staining of OCN in BMSCs in various groups（40）873第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）osteogenesis and angiogenesisJ.Front Pharmacol，2022，13：855393.5 ZHANG J Q，ZHANG Q，XU Y R，et al.Synthesis and in vitro anti-inflammatory activity of C20 epimeric ocotillol-type triterpenes and protopanaxadiolJ.Planta Med，2019，85（4）：292-301.6 GUO W N，LI Z Y，YUAN M，et al.Molecular insight into stereoselective ADME characteristics of C20-24 epimeric epoxides of protopanaxadiol by docking analysis J.Biomolecules，2020，10（1）：112.7 PENG B，HE R，XU Q H，et al.Ginsenoside 20（S）-protopanaxadiol inhibits triple-negative breast cancer metastasis in vivo by targeting EGFR-mediated MAPK pathway J.Pharmacol Res，201