CaCl_%282%29预处理对TG酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响.pdf
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1、 2023 年 8 月 第 38 卷 第 4 期JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY Vol.38 No.4 Aug.2023收稿日期:2023-01-05;修回日期:2023-04-19;出版日期:2023-08-15基金项目:山东省重点研发计划项目(2021LYXZ018,2020CXGC010604);齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程重大创新专项项目(2022JBZ01-08)作者简介:王瑞雪(1996),女,山东省临沂市人,齐鲁工业大学硕士研究生,主要研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:437573166 通信作者:李迎秋(1972),女,山东
2、省菏泽市人,齐鲁工业大学教授,博士,主要研究方向为食品生物技术。E-mail:lyq 王瑞雪,李迎秋.CaCl2预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响J.轻工学报,2023,38(4):46-52,60.WANG R X,LI Y Q.Effect of CaCl2 pretreatment on structural characteristics of TGase-induced mung bean protein gels J.Journal of Light Industry,2023,38(4):46-52,60.DOI:10.12187/2023.04.006CaCl2
3、预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响 王瑞雪,李迎秋齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院,山东 济南 250353摘要:以转谷氨酰胺酶(TG 酶)诱导的绿豆蛋白凝胶(MBPG)为研究对象,探究不同浓度 CaCl2预处理对 TG酶诱导的 MBPG 结构特征的影响。结果表明:TG 酶诱导的 MBPG 蛋白条带的强度均随着 CaCl2浓度的增加而增强;低 CaCl2浓度(20 mmol/L)导致 TG 酶诱导的 MBPG 游离巯基和离子键含量均降低,表面疏水性增强,氢键和二硫键含量均增加;高 CaCl2浓度(20 mmol/L)使得游离巯基和离子键含量均增加,表面疏水性减弱,
4、氢键含量降低;CaCl2预处理使 TG 酶诱导的 MBPG 二级结构从-螺旋和-转角转化为-折叠和无规则卷曲。CaCl2预处理可改变 TG 酶诱导的 MBPG 结构特征,为 MBPG 配方食品的开发提供参考。关键词:CaCl2;转谷氨酰胺酶;绿豆蛋白凝胶;结构特征中图分类号:TS201.7 文献标识码:A 文章编号:2096-1553(2023)04-0046-080 引言绿豆蛋白中的必需氨基酸(如赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等)含量丰富,可满足人体对氨基酸的需求1。另外,绿豆蛋白及其多肽还具有抗氧化、抗真菌、抑制血管紧张素转换酶活性等功效2。然而,绿豆蛋白的溶解性、乳化性、凝胶性等功能特
5、性均较差3-4,限制了其在食品加工工业中的应用范围。蛋白质凝胶可保留水分及与颜色和风味有关的化合物,也可作为微量营养素及其他活性成分的输送载体5,其形成能力取决于结构、浓度、环境因素(如温度、压力、酶活性、化学成分(pH 值和盐离子)等)等6。转谷氨酰胺酶(TG 酶,EC 2.3.2.13)是一种转移酶,可催化谷氨酰胺残基(Gln)中的-羟胺基与赖氨酸残基(Lys)中的-氨基之间的酰基转移反应,导致共价-(-Gln)-Lys 异肽键形成及分子间或分子内交联7,从而使蛋白质(如乳清蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、肌原纤维蛋白等)表现出更强的保水性和凝胶性8。盐离子是影响蛋白质凝胶性的主要因素
6、之一,在凝胶形成和风味释放中均起着重要作用。J.X.Yan 等9研究发现,Ca2+64 王瑞雪,等:CaCl2预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响(20 mmol/L)的加入可使高粱阿拉伯木聚糖-大豆分离蛋白混合凝胶的网络结构变得规则有序,并能有效增强混合凝胶的力学强度;随着 Ca2+浓度(20 mmol/L)的增加,混合凝胶网络结构变得紊乱和粗糙,弹性、黏性和咀嚼性均显著降低。Y.Q.Xiao 等10研究发现,随着 Ca2+浓度的增加,纤维素纳米晶体-乳清分离蛋白复合凝胶的凝胶强度、黏弹性和热稳定性均逐渐升高。虽然 TG 酶和 Ca2+已成功应用于改善某些食品蛋白质的凝胶性,但
7、关于Ca2+对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶(MBPG)的影响机制研究尚无报道。基于此,本文拟用不同浓度的 CaCl2溶液预处理绿豆蛋白,用 TG 酶诱导制备 MBPG,并根据其十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白条带、游离巯基含量、表面疏水性、傅里叶红外光谱(FTIR)和分子间作用力,研究 CaCl2预处理对 TG酶诱导的 MBPG 结构特征的影响,以期从结构角度揭示 CaCl2对 TG 酶诱导的 MBPG 凝胶特性的影响机理,并为改善 MBPG 凝胶特性提供理论参考。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂去皮绿豆(蛋白质含量约 36%、脂肪含量约1%、碳水化合物含量约 15
8、%),山东返璞食品有限公司;TG 酶(酶活性为 120 U/g),山东朗科特酶制剂有限公司;CaCl2(96.0%)和其他常用试剂,均为分析纯,国药控股化学试剂有限公司。1.2 主要仪器与设备YT2204 型电子分析天平,苏州正峰电子科技有限公司;S10-3 型搅拌器,上海司乐仪器有限公司;HH-2 型数显恒温水浴锅,常州天瑞仪器有限公司;5804R 型高速离心机,德国艾本德股份公司;K9860型全自动凯氏定氮仪,海能仪器有限公司;F2700 型荧光分光光度计,日本日立公司;UV-9000 型紫外分光光度计,上海美泰仪器公司;Nicolet iS10 型傅里叶红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技公司
9、。1.3 实验方法1.3.1绿豆蛋白制备将去皮绿豆研磨成粉末(水分含量(10.90.98)%),按 m(绿豆粉末/g)V(去离子水/mL)=1 15 的比例溶于去离子水中,用 NaOH 溶液(1.0 mol/L)调 pH 值至 9.0;在 40 条件下连续搅拌 2 h,再于 4000 r/min、25 条件下离心 10 min,收集上清液;用 1.0 mol/L HCl 溶液将上清液 pH 值调至 4.5(蛋白质等电点),再次离心,收集蛋白质沉淀;用去离子水清洗蛋白质沉淀并离心 3 次;调整蛋白质沉淀重悬浮溶液(m(蛋白质沉淀/g)V(去离子水/mL)=1 10)的 pH 值至 7.0后,对其
10、进行冷冻干燥,即获得绿豆蛋白11。绿豆蛋白得率为(31.681.56)%,凯氏定氮法测得绿豆蛋白纯度为(87.981.24)%12。1.3.2 MBPG 制备配制浓度分别为 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L 和40 mmol/L 的 CaCl2溶液;在不同 CaCl2溶液中添加绿豆蛋白制备质量分数为 18%的绿豆蛋白溶液,并于室温下搅拌 1 h;将 TG 酶与绿豆蛋白溶液混合,使 TG 酶的酶活性为 30 U/g,于 40 水浴中孵育1 h,再于95 条件下加热30 min 后,立即于冰水中冷却 10 min,并于 4 条件下放置
11、24 h,即得MBPG。对 MBPG 进行冷冻干燥,备用。1.3.3 SDS-PAGE 测定 采用 12%的分离胶和 3%的浓缩胶进行 SDS-PAGE。将 10 mg 冷冻干燥的MBPG 样品加入 1 mL 还 原 性 样 品 缓 冲 液(含50 mmol/L Tris-HCl、10 mg/mL SDS、体积分数为10%的甘油、0.2 mg/mL 溴酚蓝和体积分数为 1%的-巯基乙醇,pH 值为 8.0)中,于 100 条件下加热3 min;分别取 10 L MBPG 样品和蛋白质 Mark(相对分子质量为 11245 kDa)加入浓缩胶槽,在运行缓冲液(含 50 mmol/L Tris、3
12、84 mmol/L 甘氨酸和1 mg/mL SDS,pH 值为 8.3)中先以 80 V 电压运行30 min,再以 120 V 电压运行 2 h。电泳结束后,先将凝胶置于固定液中固定 2 h,再用 2.5 mg/mL 考马斯亮蓝 R-250 溶液染色 2 h,最后用脱色液脱色,直至蛋白条带变清晰11。1.3.4 游离巯基含量测定将 50 mg 冷冻干燥的MBPG 样品溶于 5 mL Tris-Gly 缓冲液(含 86 mmol/L Tris、90 mmol/L 甘氨酸和 4 mmol/L EDTA,pH 值为 8.0)中,于 25、10 000 r/min 条件下离心 10 min;取 3
13、mL 上清液,与 30 L 4 mmol/L 的 Ellmans 试74 2023 年 8 月 第 38 卷 第 4 期剂(5,5-二硫双-2-硝基苯酸溶于 Tris-Gly 缓冲液)混合,置于暗处孵育 1 h 后,在 412 nm 处测定其吸光度13。MBPG 游离巯基含量计算公式为:游离巯基含量=73.53 A412 DC式中,73.53 为 106/13 600(13 600 为 Ellmans 试剂的摩尔吸光度),A412为混合物在 412 nm 处的吸光度,D 为 稀 释 系 数,C 为 MBPG 质 量 浓 度/(mg mL-1)。1.3.5 表面疏水性测定将冷冻干燥的 MBPG
14、样品分散于 0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 值为7.0)中,稀释至 0.05 mg/mL;取 4 mL 稀释溶液与20 L 8.0 mmol/L 的 ANS 溶液(8-苯胺-1-萘磺酸溶解于 0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液中,pH 值为 7.0)混合后,在黑暗中贮存 20 min。用荧光分光光度计测定反映 MBPG 表面疏水性的荧光强度14,设置激发波长和发射波长分别为 374 nm 和 485 nm。1.3.6 FTIR 测定将 2 mg 冷冻干燥的 MBPG 样品于 198 mg KBr 一起研磨,压成 12 mm 的薄片;将该薄片在 4004000 cm-1的波数内扫描
15、64 次,分辨率为 4 cm-115。使用 Peakfit v4.12 分析蛋白质的二级结构。1.3.7 分子间作用力测定将 50 mg 冷冻干燥的 MBPG 样品分别分散于 5 mL S1 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 溶液)、5 mL S2 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 和1.5 mol/L 尿素溶液)、5 mL S3 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 和 8 mol/L 尿 素 溶 液)及 5 mL S4 溶 液(含 0.6 mol/L NaCl、8 mol/L 尿素和 0.5 mol/L-巯基乙醇溶液)中;将分散体置于室温下孵育 1 h,于 25、8000 r
16、/min 条件下离心 20 min;以牛血清白蛋白为标准品,采用 Lowry 法测定上清液中的可溶性蛋白含量16。S1、S2-S1、S3-S2 和 S4-S3 的溶解度分别代表离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键的贡献17。1.4 数据处理与分析实验至少重复 3 次,数据结果以(平均值标准差)表示。使用 IBM SPSS Statistics 23 软件进行单因素方差分析和邓肯多重范围检验,以确定组间差异显著性(P100 kDa)的形成。一些聚合物保留在堆积凝胶中,不穿透分离凝胶。这可能是 TG 酶催化的谷氨酰胺和赖氨酸反应残基共价交联后的蛋白质聚集所致18。随着 CaCl2浓度的增加,TG 酶
17、诱导的 MBPG 蛋白条带强度均增强。这可能是因为CaCl2可促进 TG 酶诱导的 MBPG 蛋白质聚集体的解离,形成不同相对分子质量的蛋白质亚基19。该结果与王家琛20的研究结果较一致。图 1 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的MBPG SDS-PAGE 的影响Fig.1 Effect of CaCl2 pretreatment on the SDS-PAGE of TGase-induced MBPG2.2 游离巯基含量分析暴露在蛋白质分子表面的巯基被称为游离巯基,其易通过氧化作用形成二硫键,从而改善凝胶的网络结构21。CaCl2预处理对 TG 酶诱导的 MBPG游离巯基含量的影响如图 2
18、 所示,其中不同上标小写字母表示组间差异显著(P20 mol/L,下同)可使更多游离巯基暴露。该结果与 L.W.Cao 等23的研究结果较一致。图 2 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的MBPG 游离巯基含量的影响Fig.2 Effect of CaCl2 pretreatment on the free sulfhydryl content of TGase-induced MBPG2.3 表面疏水性分析蛋白质的表面疏水性是蛋白质的主要结构特征之一,可评价疏水基团的分布情况8。CaCl2预处理对 TG 酶诱导的 MBPG 表面疏水性的影响如图 3所示。由图 3 可知,随着 CaCl2浓度的增
19、加,反映TG 酶诱导的 MBPG 表面疏水性的荧光强度先升高后降低;当 CaCl2浓度为 20 mmol/L 时,荧光强度达到最大值 4578 a.u.。与 0 mmol/L CaCl2预处理组相比,经低浓度 CaCl2预处理后,荧光强度增强,这可能是因为 CaCl2可促进蛋白质分子的疏水结构域展开,进而使疏水基团暴露24。此外,CaCl2会破坏蛋白质表面的水化层及电荷平衡,导致 Ca2+与蛋白质竞争水分子,以及蛋白质排斥水分子和蛋白质聚集的倾向增加,这可增强 TG 酶诱导的 MBPG 表面疏水性25。然而,经高浓度 CaCl2预处理后,荧光强度降低,这可能是因为 CaCl2可促进绿豆蛋白过度
20、聚集,进而埋藏部分疏水基团19。该结果与S.Jeyarajah 等26的研究结果较一致。2.4 FTIR 分析FTIR 可用于反映蛋白质的构象和官能团的拉伸振动情况。CaCl2预处理对 TG 酶诱导的 MBPG FTIR 的影响如图 4 所示,其中酰胺 A 的峰值是由NH 和 OH 键在 30003500 cm-1处的拉伸振动引起的,可反映蛋白质氢键的强度。由图 4 可知,在3290 cm-1处,经 0 mmol/L CaCl2预处理时,TG 酶诱导的 MBPG 酰胺 A 带的透过率为 46.0%;随着CaCl2浓度的增加,TG 酶诱导的 MBPG 酰胺 A 带的透过 率 先 从 71.5%(
21、5 mmol/L)降 低 到 39.2%(30 mmol/L),再升高到 57.1%(40 mmol/L)。这表明低浓度和高浓度 CaCl2预处理均会导致 TG 酶诱导的 MBPG 氢键被削弱,而在适当 CaCl2浓度下,TG 酶诱导的 MBPG 氢键则会被增强。图 3 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的MBPG 表面疏水性的影响Fig.3 Effect of CaCl2 pretreatment on the surface hydrophobicity of TGase-induced MBPG图 4 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的MBPG FTIR 的影响Fig.4 Effect o
22、f CaCl2 pretreatment on FTIR of TGase-induced MBPG94 2023 年 8 月 第 38 卷 第 4 期酰胺带与 CO 和 CN 键的拉伸振动有关,可表征蛋白质的二级结构,主要包括-螺旋(16501660 cm-1)、-转角(16601700 cm-1)、-折叠(1600 1640 cm-1)和无规则卷曲(1640 1650 cm-1)。CaCl2预处理对 TG 酶诱导的 MBPG蛋白质二级结构组成的影响见表 1。由表 1 可知,TG 酶诱导的 MBPG 主要二级结构是-折叠和-转角。CaCl2预处理略微 降 低 了 TG 酶 诱 导 的MBPG
23、-螺旋和-转角结构,略微增加了-折叠和无规则卷曲结构。这可能与 CaCl2预处理促进了绿豆蛋白分子展开及蛋白质间的相互作用有关27。此外,蛋白质表面疏水性的增强也会降低-螺旋结构的含量28。Ca2+对蛋白质分子间的静电屏蔽作用及对氢键键合的影响均会改变蛋白质分子的构象,促进蛋白质的聚集和交联,进而形成更多的-折叠结构29。而绿豆蛋白中肽链的旋转受凝胶结构形成的限制,因此-转角结构的含量降低25。该结果与 Z.Z.Zhang 等25的研究结果较一致。酰胺带出现在 15001600 cm-1范围内,对应于 CN 键的拉伸和 NH 键的弯曲振动。由图 4可知,随着 CaCl2浓度从5 mmol/L
24、增加到 30 mmol/L,酰胺 带的透过率从 73.9%降低到 41.3%,当CaCl2浓度为40 mmol/L 时,酰胺带的峰值强度再次增加到 58.0%。这表明 CaCl2预处理可使 TG 酶诱导的 MBPG 酰胺键增加,进而增强 CN 键的拉伸和 NH 键的弯曲振动30。2.5 分子间作用力分析分子间作用力由凝胶在不同溶液中的蛋白质溶 表 1 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的 MBPG 蛋白质二级结构组成的影响Table 1 Effect of CaCl2 pretreatment on the protein secondary structure composition of T
25、Gase-induced MBPGCaCl2浓度/(mmol L-1)蛋白质二级结构组成/%-螺旋-转角-折叠无规则卷曲021.120.22a25.950.20a30.090.15d22.830.17cd520.690.17b25.060.18c30.800.18bc23.450.24ab1020.670.20b24.680.23d31.070.20b23.590.20a2020.860.16ab25.370.20bc30.690.18c23.090.23bc3020.960.17ab25.540.19b30.280.16d23.230.19ab4020.980.19ab24.410.22d3
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