DB65∕T 4669-2023 小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法(新疆维吾尔自治区).pdf
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1、ICS 65.020.30CCS B 41B65新 疆维吾 尔自治 区地方 标 准DB 65/T 46692023小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法Detection method of peste des petits ruminants virus and orf virus by duplex real-time fluorescence quantitative PCR2023-07-20 发布2023-09-20 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布JDB 65/T 466920231/1刖 3本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第
2、1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提出。本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位:新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北京亿 森宝生物科技有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)、新疆生 产建设兵团畜牧兽医工作总站。本文件主要起草人:马晓艳、孙雨、王文、刘亚涛、惠志华、王新杰、夏俊、马伟、李舵、苏贵成、苏晓慧、薛文、秦菊、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、马亚珍、符玉涓、艾日登才次克、李 璐、张丹、沙那瓦尔塔希、任娟、美热木古丽巴依待拉提、乌那尔汗吉斯
3、汗、孙晓明、冯冰、陈玲、高姗姗、颜成旭、陆桂丽、茹仙古丽木明、加米拉、加伊娜古力、特列克库拉别克。本文件实施应用的疑问,请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号、新疆 维吾尔自治区动物疾病预防控制中心(新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号)、中国动物疫 病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、北京亿森宝生物科技有限公司(北京市北京经济技术开 发区(通州)科创东五街2号)、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)(新 疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区冬融街726号)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站(新疆乌鲁木齐 市米东区米东南路2188
4、号红光雅居小区7号公建楼)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(新疆乌鲁木齐 市新华南路167号)。对本文件的修改意见建议,请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号、新 疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心(新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号)、中国动物 疫病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(新疆乌鲁木齐市 新华南路167号)。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话:0991-8568089;传真:0991-8527722;邮编:830004新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话:0991-4626082;传真:0991-
5、4641491;邮编:830013中国动物疫病预防控制中心联系电话:010-59198917,传真:010-59198917;邮编:100125北京亿森宝生物科技有限公司联系电话:010-67832149,传真:010-65502970;邮编:100176 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话:0991-2818750;传真:0991-2311250;邮编:830004IDB 65/T 46692023小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法1范围本文件规定了小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的试剂和引物、仪器用具与耗材、实验步骤、检测结果
6、的判定。本文件适用于新疆小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂和引物处规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验室用水应符合GB/T 6682的规定执行;pH 7.4磷 酸盐缓冲液(PBS)溶液配制应符合GB/T 27982的规定;DNA/RNA提取相关试剂见附录A,实时荧光PCR 检测引物探针见附录B。5仪器用具与耗材高速冷冻离心机、电子
7、天平、高通量核酸提取仪、荧光定量PCR仪、-20低温冰箱和-80超低温 冰箱、高通量研磨仪、pH计、高压灭菌锅、生物安全柜、微量振荡器、瞬时离心机、可调移液器(10包,20吐,100此,200吐,1000(iL)和对应的无RNA灭菌可调移液器吸头、无RNA灭菌离心管、研磨管、吸附柱等。6操作步骤6.1 样品的采集、存储6.1.1 拭子样品选择处于发热期(体温40 C41)、排出脓性、浆液性眼分泌物、出现口腔溃疡症状的活畜采 集样品,采集眼结膜拭子2个、鼻粘膜拭子2个,分别置于4 c条件下保存的1000此灭菌磷酸盐缓冲液 DB 65/T 46692023(0.01 mol/L pH 7.4,PB
8、S)中。将含有渗出物的棉拭子在微量振荡器上充分混合,捻动、挤压干后弃 去拭子。12000 r/min离心5 min,吸取上清300凡于1.5 mL灭菌离心管中,编号备用。6.1.2全血样品按照常规方法抽取2 mL3 mL血液,放置含有EDTA-Na?抗凝剂的5 mL试管中,编号备用。6.1.3组织样品选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24 h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3 个4个,脾、胸腺、肠粘膜和肺组织各约25 g50 g,分别置于50 mL离心管或密封袋中。每份组织分 别从三个不同位置取样,称取样品约1g,用手术剪剪碎的样品混匀后取0.1 g装入研磨管,于高通量研 磨仪中
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