香蕉GDSL脂肪酶基因家族全基因组鉴定与表达分析_张城瑜.pdf
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1、张城瑜,任纹慧,耿小慧,等.香蕉 GDSL 脂肪酶基因家族全基因组鉴定与表达分析J.福建农业学报,2022,37(11):14151429.ZHANGCY,RENWH,GENGXH,etal.Genome-wideIdentificationandExpressionsofBananaGDSLLipaseGeneFamilyJ.Fujian Journal ofAgricultural Sciences,2022,37(11):14151429.香蕉 GDSL 脂肪酶基因家族全基因组鉴定与表达分析张城瑜1,任纹慧1,耿小慧1,李丹1,吴昊1,倪珊珊1,王梦鸽1,罗彬彬1,徐涵1,2,赖钟雄1*
2、(1.福建农林大学园艺学院/园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;2.图卢兹综合科学研究所,法国图卢兹31300)摘要:【目的】揭示香蕉 GDSL 脂肪酶基因家族(MaGDSL)序列特征及其在香蕉生长发育过程中的潜在功能。【方法】利用生物信息学方法对 MaGDSL 进行全基因组鉴定,分析其染色体、启动子顺式作用元件和转录因子结合位点(TFBS)的分布情况以及编码蛋白的理化性质、基因结构、保守基序和系统进化关系,并基于转录组数据库分析 MaGDSLs 在高温(45)/低温(4)处理的叶片、枯萎病菌FocTR4 侵染的根系以及自然成熟/乙烯催熟的不同成熟阶段的果实中的表达模式,同时利用实时
3、荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析部分 MaGDSL 成员在花粉中的表达情况。【结果】香蕉 A 基因组中有 76 个 MaGDSL 成员,分布于 11 个染色体上,可分为 9 个亚家族,各成员编码区长度为 10142193bp,其中有 5 个成员含有不同数量的转录本;多数 MaGDSL 成员包含 5 个外显子和 4 个内含子,编码蛋白具有信号肽且主要定位在内外膜上;启动子区存在多种植物激素和逆境胁迫相关响应元件以及 22 种TFBSs;MaGDSLs 中有 3 个串联重复基因簇位于 4、8 号染色体,6 个串联重复基因对分别位于 1、6、7、8、9 和10 号染色体上,22 对片段重复基因
4、分布在除 11 号染色体外的所有染色体上。MaGDSLs 在香蕉叶片和根部的表达水平差异较大,且个别成员受高、低温胁迫以及枯萎病菌调控,其中 5 个成员(MaGDSL4-5、8-1、8-12、9-4、9-5)受高、低温胁迫抑制表达,而 MaGDSL2-1 和 MaGDSL6-8 受高、低温胁迫诱导表达,MaGDSL4-1 和 MaGDSL11-1 受低温和 FocTR4 调控,MaGDSL58 仅响应低温胁迫,其中 MaGDSL2-2 和 MaGLP10-5 对各种处理均有响应,而MaGDSL1-1 在根系和花粉中均有高表达。【结论】MaGDSLs 可能在香蕉生长发育过程中发挥重要作用,同时部
5、分成员特异响应生物和非生物胁迫。关键词:香蕉;GDSL 脂肪酶;基因组;逆境胁迫;表达分析中图分类号:S668.1文献标志码:A文章编号:1008-0384(2022)11141515Genome-wide Identification and Expressions of Banana GDSL Lipase Gene FamilyZHANGChengyu1,RENWenhui1,GENGXiaohui1,LIDan1,WUHao1,NIShanshan1,WANGMengge1,LUOBinbin1,XUHan1,2,LAIZhongxiong1*(1.Institute of Horti
6、cultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350002,China;2.Institute de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse,IRIT-ARI,Toulouse31300,France)Abstract:【Objective】Sequences and functions of banana GDSL lipase gene family(MaGDSL)were studied.【Methods】Bioinformati
7、cswasappliedtoidentifythegenomes,analyzethedistributionsofchromosomes,promotercis-actingelements,andtranscriptionfactorbindingsites(TFBS),anddeterminethephysicochemicalproperties,genestructure,conservedmotifs,andphylogeneticrelationshipsoftheencodedproteinsoftheMaGDSLfamily.Basedonthetranscriptomeda
8、tabase,theexpressionsofMaGDSLsinthehigh(45)-orlowtemperature(4)-treatedleaves,FocTR4-infestedroots,andthenaturalorethyleneripenedfruitsweremeasured.AndqRT-PCRwasemployedtoobtaintheexpressionsofMaGDSL收稿日期:20220324初稿;20220614修改稿作者简介:张城瑜(1996),男,硕士,研究方向:园艺植物生物技术(E-mail:)*通信作者:赖钟雄(1966),男,博士,研究员,研究方向:园艺
9、植物生物技术与遗传资源(E-mail:)基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFD1000901);国家现代农业产业技术体系(香蕉)建设专项(GARS-31-15);福建省高原学科建设项目(102/71201801101)福建农业学报2022,37(11):14151429http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.007membersinpollen.【Results】ThebananaAgenomehad76MaGDSLsof9subfamiliesdistrib
10、utedon11chromosomes.Thecodingregionofeachmemberwas10142193bp.Fiveofthememberscontainedvariednumberoftranscripts,butmostofthemhad5exonsand4introns.Theencodedproteinshadsignalpeptideslocalizedmainlyintheinnerandoutermembranes.TheMaGDSLshad3tandemrepeatclustersonchromosomes4and8,6tandemrepeatpairsonchr
11、omosomes1,6,7,8,9,and10,and22fragmentrepeatpairsonallexceptchromosome11.TheexpressionsofMaGDSLsinbananaleavesandrootswerehighlyvariablewithindividualmembersregulatedbyhighandlowtemperaturestressesaswellastheblastfungus.Fivemembers(i.e.,MaGDSL4-5,8-1,8-12,9-4,9-5)wererepressed,butMaGDSL2-1andMaGDSL6-
12、8induced,byhigh-orlow-temperature exposure,while MaGDSL4-1 and MaGDSL11-1 regulated by low temperature and FocTR4,MaGDSL5 8respondedonlytolowtemperature,MaGDSL2-2 and MaGLP10-5 sensitive to various treatments,and MaGDSL1-1 highlyexpressedintherootsandpollens.【Conclusion】MaGDSLsmightplayanimportantro
13、leinthegrowthanddevelopmentofbananaplants.Someofthemembersrespondedspecificallytocertainbioticand/orabioticstresses.Key words:Banana;GDSLlipasegene;genome;stressbyadversity;expressionanalysis0引言【研究意义】脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)作为一种水解脂质的酶,具有底物专一性和区域特异性等特点,普遍存在于各类生物中。植物脂肪酶一般都含有信号肽,且以丝氨酸为活性中心1。根据它们保守序列的特点,一般
14、将脂肪酶分为 GxSxG-motif和 GDSL 脂肪酶。而 GDSL 脂肪酶含丝氨酸的基序更靠近 N 端,所以它们与真正意义上的脂肪酶基本没有序列同源性2。GDSL 脂肪酶具有灵活的活性位点,它们在存在不同底物的情况下会改变结构。因此,某些 GDSL 脂肪酶具有广泛的酶活性,包括同一类酶中的酯酶和蛋白酶活性34。研究表明,GDSL脂肪酶在植物的生长发育、形态建成以及应对胁迫等方面有重要作用5。我国是香蕉的第二大生产国和重要的消费国,香蕉作为广受喜爱的水果以及粮食作物,其经济价值和地位举足轻重。但是香蕉的产量和品质一直面临着各种自然灾害和病菌的威胁,我国的香蕉产业也饱受寒潮等自然灾害的考验6。
15、因此研究香蕉 MaGDSL 家族对揭示其逆境胁迫的响应机制从而进一步提高香蕉抗性具有重要意义。【前人研究进展】随着基因组学和生物信息学的发展,数量庞大的 GDSL 脂肪酶基因在越来越多的植物中被鉴定出来,例如模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)有108 个 成 员7,水 稻(Oryza sativa)有114 个8,西瓜(Citrullus lanatus)有 65 个9,玉米(Zea mays)和葡萄(Vitis vinifera)分别有 53、96 个10。Emily等11研究发现拟南芥 GDSL 成员 EXL4 脂肪酶能促进花粉在干燥柱头的水合作用,增加柱头黏性从而提
16、高授粉率。Huang 等12在拟南芥种子萌发和幼苗生长过程中对 GDSL 新成员 SFAR4 进行过表达处理,发现可提高种子对葡萄糖的耐受度从而提高发芽率。Ruth 等13则发现拟南芥在遭遇冻害时 GDSL 脂肪酶能够改变细胞膜的结构,从而提高冷冻耐受性。Hong 等14对辣椒 CaGLIP1 同源物进行类似的研究,发现其受多种胁迫因子的诱导,CaGLIP1 表达下调的辣椒植株增强了对野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria)的本底抗性。水稻 OsGLIP1和 OsGLIP2 通过调节脂质代谢来负调控水稻防御能力15。目前的研究已经证实 GDSL
17、脂肪酶在调节植物生长发育、组织器官的形态建成、非生物胁迫和次生代谢产物的合成等众多方面发挥着关键的作用1619,且在植物各个生长阶段都有着特异性功能,因此对于香蕉 GDSL 脂肪酶的研究利用有很大的前景和发展潜力。而 Dhont 等在 2012 年完成了香蕉 A 基因组(小果野蕉)的全基因组测序,为香蕉分子调控机制的研究提供了理论支持,为香蕉 GDSL家族的研究提供了便利20。【本研究切入点】GDSL脂肪酶在提高植物生物和非生物胁迫抗性方面的作用机理得到了越来越多的关注,但在香蕉中研究较少,特别是 GDSL 脂肪酶在香蕉中的分子响应机制对于提高其抗性、改良香蕉种质资源等方面。【拟解决的关键问题
18、】本研究基于香蕉 A 基因组的序列信息鉴定香蕉 MaGDSL 家族成员,并进行系列生物信息学分析和不同逆境胁迫及生长发育过程中的表达模式分析,以期进一步揭示 MaGDSL 的功能和表达模式,为该家族成员在香蕉抗病育种研究中的应用提供理论基础。1材料与方法1.1MaGDSL 家族成员鉴定鉴定香蕉(A 基因组)成员所用 gDNA、CDS和1416福建农业学报第37卷蛋白序列均下载自马来西亚小果野蕉数据库(https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/)。查询文献获得水稻GDSL基因家族成员的登录号7,从水稻基因组数据库(RGAP,http:/rice.plantbi
19、ology.msu.edu)下载114条水稻GDSL 家族蛋白序列。在Pfam 数据库(http:/pf-am.xfam.org/)下载SGNH_plant_lipaselike(PF00657)的隐马氏模型,通过hmmer3.0软件进行搜索;然后去除重复序列,进一步使用NCBI 的CDD(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)进行结构域验证,保留含有SGNH_plant_lipase_like 的序列,最终筛选获得 76 条候选序列。1.2香蕉 GDSL 脂肪酶的蛋白理化性质及基因结构分析运用在线网站分别对香蕉 GDSL 脂肪酶的蛋白 基 本 理 化 性 质(ExP
20、ASy,https:/web.expasy.org/protparam/)、信号肽(SignalP4.0Server,http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)、跨 膜 结 构(TMHMMServerv.2.0,http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和亚细胞定位(CELLOv.2.5,http:/cello.life.Nctu.edu.tw/)等进行预测分析21。使用 MEME(http:/meme-suite.org/tools/meme)在线分析该家族成 员 编 码 蛋 白 的 保 守 基 序。利 用 GSDS
21、(http:/ MaGDSL 基因结构。通过 TBtools22软件对基因结构和保守基序图进行可视化。1.3MaGDSL 家族成员系统进化树的构建由于和模式植物各成员蛋白序列进化距离较远,因 此 使 用 MEGA7.0 中 的 ClustalW 对 香 蕉 的MaGDSL 蛋白序列进行多重序列比对,采用最大似然法(Maximumlikelihood)在默认参数下构建系统进化树。1.4MaGDSL 家族成员染色体定位和基因复制事件分析使 用 MCscanX 软 件,在 默 认 参 数 下 分 析MaGDSL 家族成员的复制事件并结合家族成员的染色体位置信息,利用 Circos 软件绘制基因染色体
22、定位和共线性关系图。使用 KaKs_Calclator2.0 软件在NG 算法下计算 MaGDSL 复制的异义替换(Ka)和同义替换(Ks)值。1.5MaGDSL 家族启动子顺式作用元件及转录因子结合位点预测在香蕉基因组数据库(https:/banana-genome-hub.southgreen.fr/)提取 MaGDSL 家族成员基因转录起始位点上游 2000bp 的序列,使用 PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线网站对各成员启动子顺式作用元件进行预测统计分析。运用PlantTFDB(
23、http:/ P1106进行 MaGDSLs启动子转录因子结合位点预测。1.6MaGDSLs 的转录组表达分析课题组前期以天宝蕉为材料,分别对4 处理24h 的幼苗叶片和 45 处理3d 的幼苗叶片及对应的 28 培养的香蕉叶片(对照)、接种香蕉枯萎病菌 FocTR4 的根系及健康对照、采后自然成熟和乙烯处理0(乙烯处理后立即取样)、1、3和5d的果实进行转录组测序。从课题组前期的转录组中提取MaGDSLs 的表达数据,以 log2(TPM/FPKM+1)进行转换,以 TPM 值表示低温叶片的表达数据,其余均以 FPKM 值表示,采用 TBtools 对各成员表达量进行可视化。1.7MaGDS
24、Ls 在福州野生蕉花粉中的 RT-PCR 表达分析将 MaGDSLs 与 EXL4 进行序列比对,筛选出与EXL4 结构相似度较高的 11 个成员,并对各成员在福建野生蕉花粉中的表达水平进行 qPCR 分析。采用 RNAprepPurePlantKit试剂盒(天根,中国)分别提 取 福 州 野 生 蕉 最 外 层 至 往 内 第 4 层 花 粉 的 总RNA,并利用 Prime-ScriptRTreagentKit(PerfectReal Time,Takara)试 剂 盒 合 成 用 于 qRT-PCR 的cDNA 模板,使用RocheLightCycler480实时荧光定量PCR 仪扩增,
25、设计 20L 反应体系,其中SYBERGreenPCRMix10L,上下游引物各0.8L,cDNA模板 1L,以 ddH2O 补足,设计 3次生物学重复;扩增程序:95 预变性30s;95 变性 5s,60退火 30s,72 延伸 30s,50 个循环;以 UBQ 为内参基因,采用 2CT法计算相对表达量,qRT-PCR所用引物见表 1。2结果与分析2.1MaGDSL 基因家族成员信息在香蕉基因组中共鉴定获得 76 个 MaGDSL 成员,其中 5 个成员(Ma02_g14360、Ma03_g25700、Ma04_g37620、Ma06_g0430、Ma06_g30580)存在两个不同转录本,
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