葛根素通过抑制MAPK_NF-κB信号通路调节LPS诱导的人牙髓干细胞的炎症损伤和成骨分化.pdf
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1、作者单位:,长治市北大医疗潞安医院口腔科(支旺温惠慧),长治医学院附属和济医院口腔科(崔志强)通信作者:支旺 :葛根素通过抑制 信号通路调节 诱导的人牙髓干细胞的炎症损伤和成骨分化支旺温惠慧崔志强【摘要】目的:探讨葛根素()对炎症条件下人牙髓干细胞()成骨分化的影响及机制。方法:分离培养 ,法检测 对 增殖活力的影响。将 分为对照组、脂多糖()组、抑制剂 组()、组、组、组,采用 诱导建立体外 炎症模型。通过乳酸脱氢酶()测定法、茜素红染色和碱性磷酸酶()活性测定评估 对 诱导的 细胞毒性和成骨分化能力的影响,实时荧光定量 ()检测细胞中炎症(、)和成骨分化相关基因(、)表达,检测细胞中丝裂原
2、活化蛋白激酶()核因子 ()通路相关蛋白表达。结果:和 的 可显著增加 的增殖活力,增强 刺激的 中 活性、矿化结节和成骨分化相关基因的表达,降低 活性和炎症相关基因表达,抑制 的磷酸化降解和 、的磷酸化(均 )。与 对 信号通路的抑制作用接近,两者联用对 信号通路的抑制作用和炎症状态下 成骨分化的促进作用明显优于两者单独应用。结论:可减轻 诱导的 炎症损伤,促进炎症状态下 成骨分化;其作用机制可能与抑制 信号通路有关。【关键词】牙髓炎;葛根素;人牙髓干细胞;脂多糖;成骨分化;丝裂原活化蛋白激酶;核因子 【中图分类号】,【文献标志码】【】,;,【】:()():,(,),(),(),(),()(
3、):,(),:;【】;牙髓炎是由龋齿或外伤引起的牙齿急性或慢性炎症,已成为危害口腔健康的常见病 。根管治疗是牙髓炎常用疗法,但易导致牙齿脆性增加并缩短牙齿存实用口腔医学杂志(),()活时间 。因此,需要开发新方案。细菌感染是牙髓再生过程中的强大障碍。细菌脂多糖(,)可刺激细胞分泌促炎因子,引起牙齿炎症反应 。人牙髓干细胞(,)具有治疗牙髓疾病的潜力 。但针对炎症条件下 修复能力的研究较少。核因子 (,)和丝裂原活化蛋白激酶(,)通路是主要的炎症通路 。抑制 和 通路可抑制炎症介质的产生,增强成骨细胞或成牙本质细胞分化,是促进牙髓组织再生的潜在靶点 。葛根素(,)具有 抗 炎 和 抗 菌 作 用
4、 。据 报 道,通 过 抑 制 信号通路抑制破骨细胞生成 ;还可通过 信号通路刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化和骨形成 。然而,对炎症条件下 成骨分化的影响及作用机制尚不清楚。因此,本研究旨在探究 对炎症条件下 成骨分化的影响及潜在机制。材料与方法 分离、培养和鉴定从健康志愿者(岁,没有龋齿和炎症)的第三磨牙获得牙髓组织。将牙髓组织切成小块,用 型胶原酶在 下消化 后,将细胞悬浮在含有 胎牛血清()和 青霉素 链霉素的 培养基中培养。后,细胞成功从牙髓组织中爬出。每天更换次培养基,培养达到 融合后,进行传代。将细胞用胰蛋白酶消化 ,然后,以 离心 ,将细胞沉淀重悬于完全培养基中。为了评估细胞活力
5、,将等体积的细胞悬浮液和 台盼蓝混合,并将 制备好的样品装入血细胞计数器的每个腔室中。在制备样品后 内对活细胞和非活细胞进行计数。具有超过 存活率的细胞悬液以 的比例进行传代培养(第 代)。取第 代细胞用于实验。通过流式细胞术评估 的表面标志物。用 胰蛋白酶消化细胞并与以下抗体在室温下避光孵育 :抗 、抗 、抗 、抗 、抗 和抗 。将细胞重悬后使用流式细胞仪分析。主要试剂与仪器 (纯度 )、(抑制剂)(、,美国);、乳酸脱氢酶(,)活性检测试剂盒(、,北京 公司);碱性磷酸酶(,)测定试剂盒(,南京建成);一抗:(,)、()、(,)、()、(,)、()(公司,美国)。流式细胞仪(公司,美国);
6、型荧光定量 仪(应用生物系统公司,美国)。法检测 对 增殖活力的影响将 个细胞 孔接种在 孔板中并孵育过夜。然后,将细胞暴露于含有 、和 或对照(对照,)的 培养基中。培养、后,每孔加入 工作液(),继续培养 ;使用酶标仪在 处测量每个孔的吸光度值(值)。测定法评估 对 诱导的 细胞毒性将 个细胞 孔接种在 孔板上并培养过夜,分为:对照组、组、组()、组、组、组(),除对照组外,其余各组将 添加到 的培养基中以模拟 炎症 。在用 处理前,组用 处理 ;各剂量组用 、处理 ,组用 和 共同处理 。然后,收集细胞并取无细胞上清液,按照试剂盒说明检测 活性。茜素红染色检测 成骨分化能力 以 个 孔的
7、密度接种于 孔培养板内,按照“”项下方法进行分组与处理,然后与成骨分化培养基一起培养 ,每 天更换一次成骨分化培养基。后,将细胞用 多聚甲醛固定、茜素红染色。显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照,并采用 氯化十六烷基吡啶溶解矿物质沉积物,在 处测量 值来量化染色强度。活性测定 按照“”项下方法进行分组与处理,在诱导成骨分化第,弃去培养液,使用 裂解细胞,将细胞裂解上清液加入 孔板(孔)中,使用 活性检测试剂盒测定 活性。实时荧光定量 ()检测细胞中 、和 、表达使用 试剂从细胞中提取总 。然后将提取的 逆转录为 。用实用口腔医学杂志(),()于定量基因表达。条件包括在 下 的初始变性,然后是 和
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