葛根素通过抑制MAPK_NF-κB信号通路调节LPS诱导的人牙髓干细胞的炎症损伤和成骨分化.pdf

作者单位：，长治市北大医疗潞安医院口腔科（支旺温惠慧），长治医学院附属和济医院口腔科（崔志强）通信作者：支旺 ：葛根素通过抑制 信号通路调节 诱导的人牙髓干细胞的炎症损伤和成骨分化支旺温惠慧崔志强【摘要】目的：探讨葛根素（）对炎症条件下人牙髓干细胞（）成骨分化的影响及机制。方法：分离培养 ，法检测 对 增殖活力的影响。将 分为对照组、脂多糖（）组、抑制剂 组（）、组、组、组，采用 诱导建立体外 炎症模型。通过乳酸脱氢酶（）测定法、茜素红染色和碱性磷酸酶（）活性测定评估 对 诱导的 细胞毒性和成骨分化能力的影响，实时荧光定量 （）检测细胞中炎症（、）和成骨分化相关基因（、）表达，检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶（）核因子 （）通路相关蛋白表达。结果：和 的 可显著增加 的增殖活力，增强 刺激的 中 活性、矿化结节和成骨分化相关基因的表达，降低 活性和炎症相关基因表达，抑制 的磷酸化降解和 、的磷酸化（均 ）。与 对 信号通路的抑制作用接近，两者联用对 信号通路的抑制作用和炎症状态下 成骨分化的促进作用明显优于两者单独应用。结论：可减轻 诱导的 炎症损伤，促进炎症状态下 成骨分化；其作用机制可能与抑制 信号通路有关。【关键词】牙髓炎；葛根素；人牙髓干细胞；脂多糖；成骨分化；丝裂原活化蛋白激酶；核因子 【中图分类号】，【文献标志码】【】，；，【】：（）（）：，（，），（），（），（），（）（）：，（），：；【】；牙髓炎是由龋齿或外伤引起的牙齿急性或慢性炎症，已成为危害口腔健康的常见病 。根管治疗是牙髓炎常用疗法，但易导致牙齿脆性增加并缩短牙齿存实用口腔医学杂志（），（）活时间 。因此，需要开发新方案。细菌感染是牙髓再生过程中的强大障碍。细菌脂多糖（，）可刺激细胞分泌促炎因子，引起牙齿炎症反应 。人牙髓干细胞（，）具有治疗牙髓疾病的潜力 。但针对炎症条件下 修复能力的研究较少。核因子 （，）和丝裂原活化蛋白激酶（，）通路是主要的炎症通路 。抑制 和 通路可抑制炎症介质的产生，增强成骨细胞或成牙本质细胞分化，是促进牙髓组织再生的潜在靶点 。葛根素（，）具有 抗 炎 和 抗 菌 作 用 。据 报 道，通 过 抑 制 信号通路抑制破骨细胞生成 ；还可通过 信号通路刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化和骨形成 。然而，对炎症条件下 成骨分化的影响及作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在探究 对炎症条件下 成骨分化的影响及潜在机制。材料与方法 分离、培养和鉴定从健康志愿者（岁，没有龋齿和炎症）的第三磨牙获得牙髓组织。将牙髓组织切成小块，用 型胶原酶在 下消化 后，将细胞悬浮在含有 胎牛血清（）和 青霉素 链霉素的 培养基中培养。后，细胞成功从牙髓组织中爬出。每天更换次培养基，培养达到 融合后，进行传代。将细胞用胰蛋白酶消化 ，然后，以 离心 ，将细胞沉淀重悬于完全培养基中。为了评估细胞活力，将等体积的细胞悬浮液和 台盼蓝混合，并将 制备好的样品装入血细胞计数器的每个腔室中。在制备样品后 内对活细胞和非活细胞进行计数。具有超过 存活率的细胞悬液以 的比例进行传代培养（第 代）。取第 代细胞用于实验。通过流式细胞术评估 的表面标志物。用 胰蛋白酶消化细胞并与以下抗体在室温下避光孵育 ：抗 、抗 、抗 、抗 、抗 和抗 。将细胞重悬后使用流式细胞仪分析。主要试剂与仪器 （纯度 ）、（抑制剂）（、，美国）；、乳酸脱氢酶（，）活性检测试剂盒（、，北京 公司）；碱性磷酸酶（，）测定试剂盒（，南京建成）；一抗：（，）、（）、（，）、（）、（，）、（）（公司，美国）。流式细胞仪（公司，美国）；型荧光定量 仪（应用生物系统公司，美国）。法检测 对 增殖活力的影响将 个细胞 孔接种在 孔板中并孵育过夜。然后，将细胞暴露于含有 、和 或对照（对照，）的 培养基中。培养、后，每孔加入 工作液（），继续培养 ；使用酶标仪在 处测量每个孔的吸光度值（值）。测定法评估 对 诱导的 细胞毒性将 个细胞 孔接种在 孔板上并培养过夜，分为：对照组、组、组（）、组、组、组（），除对照组外，其余各组将 添加到 的培养基中以模拟 炎症 。在用 处理前，组用 处理 ；各剂量组用 、处理 ，组用 和 共同处理 。然后，收集细胞并取无细胞上清液，按照试剂盒说明检测 活性。茜素红染色检测 成骨分化能力 以 个 孔的密度接种于 孔培养板内，按照“”项下方法进行分组与处理，然后与成骨分化培养基一起培养 ，每 天更换一次成骨分化培养基。后，将细胞用 多聚甲醛固定、茜素红染色。显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照，并采用 氯化十六烷基吡啶溶解矿物质沉积物，在 处测量 值来量化染色强度。活性测定 按照“”项下方法进行分组与处理，在诱导成骨分化第，弃去培养液，使用 裂解细胞，将细胞裂解上清液加入 孔板（孔）中，使用 活性检测试剂盒测定 活性。实时荧光定量 （）检测细胞中 、和 、表达使用 试剂从细胞中提取总 。然后将提取的 逆转录为 。用实用口腔医学杂志（），（）于定量基因表达。条件包括在 下 的初始变性，然后是 和 的 个循环。引物序列见表 。采用 方法计算目的基因的相对表达量，用 对靶基因表达进行标准化。表 用于 的引物序列 基因正向引物（）反向引物（）检测细胞中 信号通路相关蛋白表达收获 ，裂解液提取总蛋白，并使用 法进行定量。将蛋白质样品（）通过 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶分离，然后转移到 膜上。将膜用 脱脂牛奶封闭 ，然后与以下一抗 孵育过夜：（）、（）、（）、（）、（）、（）和 （）。次日，将膜与羊抗兔 二抗（）在室温下孵育 。试剂显影蛋白质条带，软件用于分析灰度值以量化结果。统计学分析采用 软件对数据进行分析，计量资料以（珋 ）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用 检验进行组间两两比较，为差异有显著性意义。结果 的表型鉴定流式细胞仪检测结果显示，表达特异性间充质干细胞抗原 、和 阳性，而造血细胞抗原 和 均为阴性（图 ）。图 的表型 实用口腔医学杂志（），（）对 增殖活力的影响在第、天，与对照组相比，、处理时 增殖活力显著增加（），而 组 增殖活力差异无统计学意义（）（表 ）。因此，后续实验选择 和 的 。表 各组 增殖活力比较（珋 ，）（珋 ，）组别细胞增殖活性（）对照组 注：与对照组相比，对 诱导的 细胞毒性的影响与对照组相比，组 中 活性显著升高（比 ，）；与 组相比，组、组和 组 活性显著降低（、比 ，）；与 组、组相比，组 活性显著降低（比 、，）。对 诱导的 成骨分化能力的影响与对照组相比，组 中矿化结节数量明显减少，染色强度和 活性显著降低（）；与 组相比，组、组和 组矿化结节数量明显增加，染色强度和 活性显著升高（）；与 组、组相比，组矿化结节数量明显增加，染色强度和 活性显著升高（）（图 ）。图 各组 的茜素红染色 对 诱导的 中成骨分化相关基因表达的影响与对照组相比，组 中 、的 水平显著降低（）；与 组相比，组、组和 组 、的 水平显著升高（）；与 组、组相比，组 、的 水平显著升高（）（图 ）。对 诱导的 中炎症相关基因表达实用口腔医学杂志（），（）的影响与对照组相比，组 中 、的 水平显著升高（）；与 组相比，组、组和 组 、的 水平显著降低（）；与 组、组相比，组 、的 水平显著降低（）（图 ）。对 诱导的 中 信号通路相关蛋白表达的影响与对照组相比，组 中 蛋白水平显著降低，蛋白水平和 、比 值 显 著 升 高（）；与 组相比，组、组和 组 蛋白水平显著升高，蛋白水平和 、比 值 显 著 降 低（）；与 组、组相比，组 蛋白水平显著升高，蛋白水平和 、比值显著降低（）（图 ）。图 各组 的茜素红染色强度和 活性（与对照组相比，：；与 组相比，：；与 组相比，：；与 组相比，：，）（，：；：；：；，：，）与对照组相比，；与 组相比，；与 组相比，；与 组相比，（图 同）图 各组 中 、的 水平 ，；，；，；，（），实用口腔医学杂志（），（）图 各组 中 信号通路相关蛋白表达 讨论 为革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可减弱 的成牙 成骨分化 ，常被用于在体外建立炎症微环境模型 。本研究采用 刺激 模拟体外炎症微环境，探索 在体外的抗炎和成骨分化功能。结果显示，当用 刺激 时，炎性细胞因子（包括 、）的表达与对照组相比增加，这与先前的研究一致 。而 处理可降低 诱导的细胞毒性，并下调促炎基因表达。据报道，可抑制破骨细胞激活因子 、和前列腺素 ，防止 诱导的破骨细胞形成、功能和骨质流失 ，并可抑制 诱导的人脐静脉内皮细胞中 活化来预防血管内皮损伤 ；这些发现进一步支持了本研究结果。提示，可减少 诱导的 炎症反应。促进炎症微环境下 的成骨分化是调节牙髓炎症和促进牙髓修复的关键。因此，本研究进一步探讨了 对炎症状态下 成骨分化能力的影响。结果显示，改善了 诱导的 中成骨分化相关基因表达的降低，增强了 活性，并增加了矿化结节的形成。表明 可促进 在炎症环境中的成骨分化。提示，可促进炎症状态下 的细胞分化和再矿化过程，可能是炎症条件下牙髓组织再生的潜在治疗剂。在抑制 诱导的 炎症方面显示出明显的优势，但其机制尚不完全清楚。本研究试图探究 发挥作用的相关信号通路。已知 诱导的炎症反应可由细胞内 信号通路的激活介导 。途径涉及 的磷酸化和随后的降解，可诱导 亚基的核转位和 依赖性基因表达。研究表明，抑制 和 信号可以抑制炎症因子的产生，改善 的成牙 成骨分化的潜力 。在本研究中，处理减少了 的磷酸化降解，抑制了 的活化并降低了 刺激的 中 的磷酸化水平；且 与 对 信号通路的抑制作用接近，两者联用对 信号通路的抑制作用和炎症状态下 成骨分化的促进作用明显优于两者单独应用。提示，对 诱导的 抗炎作用可能与抑制 信号通路有关。综上所述，可减轻 诱导的 炎症损伤，促进炎症状态下 成骨分化；其作用机制可能与抑制 信号通路有关。但仍有一些实用口腔医学杂志（），（）问题需要在以后的实验中深入分析：（）将考察 在牙髓中其他细胞系中的抗炎作用，以综合评价 控制炎症和组织再生的作用；（）将建立体内模型，阐明 的抗炎和促进成骨分化作用，并确定体内应用的最佳浓度。参 考 文 献 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：（收稿：修回：）实用口腔医学杂志（），（）