高效液相色谱-串联质谱法测定果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素.pdf
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1、第36卷第6期,2023年11月 宁 波 大 学 学 报(理 工 版)中国科技核心期刊 Vol.36 No.6,Nov.2023 JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY(NSEE)中国高校优秀科技期刊 DOI:10.20098/ki.1001-5132.2022.1006 高效液相色谱-串联质谱法测定果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素 邓 涛1,吉小凤2,肖英平2,汪 雯2,吕文涛2,王小骊2,吴 振1*,杨 华2(1.宁波大学 食品与药学学院,浙江 宁波 315832;2.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所,浙江 杭州 310021)摘要:建立高效液相色谱-串联质谱法测定
2、果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素检测方法.样品用 V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(79:20:1)提取,QuEChERS填料包(4g无水MgSO4、0.5g无水CH3COONa和 0.5g NaCl)盐析,100mg C18 净化,经过液相色谱柱分离,2mmolL1乙酸铵水溶液-甲醇为流动相梯度洗脱,由 ESI 源扫描,多反应监测模式,基质外标法定量分析.该方法中,恩镰孢菌素A(ENA)、恩镰孢菌素 B(ENB)和白僵菌素(BEA)在 0.1200gL1以及恩镰孢菌素 A1(ENA1)和恩镰孢菌素 B1(ENB1)在 1200gL1范围内线性关系良好,且线性相关系数(R2)均大于 0.998
3、9,相对标准偏差范围为 1.7%11.7%.3 个不同加标浓度的添加回收率为 88.0%114.1%,样品检测限为 1.5gkg1,样品定量限为 5gkg1.本文建立的方法简单、高效、准确,满足果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素污染筛查需求.关键词:果汁;恩镰孢菌素;白僵菌素;食品安全 中图分类号:O675.63;TS201.6 文献标志码:A 文章编号:1001-5132(2023)06-0050-07 我国是水果种植和消费大国,除鲜食外,还生产许多以水果为主要原料的加工产品(如果汁、果酱、果干、果粉等).果汁是以水果为原料经过物理方法处理得到的汁液产品.按照浓度可分为 100%纯果汁、高浓度果汁、
4、低浓度果汁.但果品在加工、贮运等过程中极易发生真菌性病害,引起腐烂或腐败,部分真菌还可能产生真菌毒素,对人体健康造成潜在危害.真菌毒素主要是由曲霉属、镰刀菌属和青霉属等丝状真菌在适宜条件下产生的次级代谢产物1.恩镰孢菌素(Enniatins,ENNs)和白僵菌素(Beauvericin,BEA)是近年来被报道的新型真菌毒素,也是镰刀菌属产生的次级代谢产物,主要污染谷物、水果及其相关制品等2,其中常见的恩镰孢菌素有恩镰孢菌素 A(EnniatinA,ENA)、恩镰孢菌素 A1(EnniatinA1,ENA1)、恩镰孢菌素 B(EnniatinB,ENB)和恩镰孢菌素 B1(EnniatinB1,
5、ENB1)1-2.研究调查表明,ENNs 和 BEA 对人和动物具有遗传毒性和细胞毒性,而且还有可能与其他生物毒素产生协同毒害作用,具体表现形式有激素紊乱、免疫抑制等1-5.现有文献资料报道中,真菌毒素检测常用方法有酶联免疫法6-7、薄层色谱法8-9、气相色谱-质谱联用法10-11、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)12-14等,其中 LC-MS/MS 因具有高通量、无需衍生化、灵敏度高、准确度高、抗干扰能力强等特点12,已成为目前同时检测多种真菌毒素的主流分析方法.由于食品基质组成成分复杂,因此样品的前处理成为检测实验的关键步骤之一.真菌毒素检测中常用的前处理方法有固相萃取技术15-1
6、6、液液萃取技术17、QuEChERS 方法18-21、加速溶剂萃取技术21等方法.QuEChERS 方法具有提取真菌毒素范围广、速度快、操作简单等特点,在真菌 收稿日期:20221012.宁波大学学报(理工版)网址:http:/ 第 6 期 邓涛,等:效液相色谱-串联质谱法测定果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素 51 毒素检测方面应用广泛20.我国尚未制定果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素的标准检测方法,因此建立一种简单、快速、灵敏、准确的检测方法具有重要意义.本文建立QuEChERS前处理方法,同时结合超高效液相色谱-串联质谱法对果汁中 ENA、ENA1、ENB、ENB1 和 BEA 进行检测,以期为果汁
7、产品中恩镰孢菌素和白僵菌素污染筛查分析提供技术支撑.1 材料与方法材料与方法 1.1 材料材料、试剂与仪器试剂与仪器 ENA、ENA1、ENB、ENB1 和 BEA 均为标准品,奥地利 RomeLab 公司;果胶酶(纯度 95),美国 Sigma Aldrich 公司;QuEChERS 填料包(分析纯无水 MgSO4、无水 CH3COONa 和 NaCl)、C18 吸附剂,山东美正生物科技有限公司;乙酸铵(质量纯度99),华东医药股份有限公司;分析纯甲酸(体积纯度88),上海凌峰化学试剂有限公司;色谱纯甲醇和乙腈,美国 Merck 公司.LC 30AD 超高效液相色谱仪,日本岛津公司;AB S
8、CIEX 6500 Qtrap 超高效液相色谱-质谱仪,美国AB SCIEX公司;ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm100mm,1.8m),美国 Waters 公司;KQ-250B 型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;BIOFUGE PRIMO R 型高速离心机,美国Thermo Fisher Scientific公司;微孔板振荡器,维根技术(北京)有限公司;Milli-Q A10 超纯水系统,美国 Millipore 公司;0.22m 有机滤膜,北京颇赛科技发展有限公司.1.2 方法方法 1.2.1 标准溶液的制备 标准储备液:用乙腈将 ENA、ENA1、ENB、E
9、NB1和BEA标准品分别配置成100.0mgL1的标准储备液.置于20下,避光保存,下同.混合标准储备液:从 100.0mgL1的 ENA、ENA1、ENB、ENB1 和 BEA 标准储备液中分别移取1mL至100mL的容量瓶中,用乙腈定容至刻度,混匀,配制成 1.0mgL1的混合标准储备液.标准系列工作溶液:用 V(甲醇):V(水)混合液(1:1)按比例稀释混合标准储备液,配制成质量浓度为 0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 gL1的标准系列工作溶液.配制基质空白标准系列工作溶液,则将V(甲醇):V(水)混合液(1:1)更换为本文前处理方法所制备的空
10、白基质溶液,其余步骤不变.1.2.2 样品提取和净化 在50mL离心管中准确称取果汁样品5.00g(准确至0.01g),依次加入200L果胶酶和25mL V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(79:20:1),常温超声提取30min,置于多管漩涡振荡器中振荡提取5min,加入 QuEChERS 填料包(4g 无水 MgSO4、0.5g 无水CH3COONa 和 0.5g NaCl),振荡混匀 1min,高速离心 5min(8500rmin1),准确移取 1.5mL上清液于 2mL 的离心管中,加入 100mg C18 净化,并涡旋震荡 30s,然后高速离心 3min(12000rmin1),
11、取 1mL 上清液,0.22m 有机滤膜过滤后 UPLC-MS/MS 分析.1.2.3 仪器条件 色谱:ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(2.1 mm100mm,1.8m),柱温 40,流动相 A 为甲醇,流动相 B 为 2mmolL1乙酸铵水溶液,进样体积为 5L.梯度洗脱程序见表 1.表 1 恩镰孢菌素和白僵菌素的梯度洗脱程序 时间/min A 相/%B 相/%流速/(mLmin1)1.0 5 95 0.2 4.0 95 5 0.2 8.0 95 5 0.2 8.1 5 95 0.2 10.0 5 95 0.2 质谱:电喷雾离子源(ESI);多反应监测(Multi-ple r
12、eaction monitoring,MRM);正离子扫描(ESI+);喷雾电压(IS)5500V;离子源温度(TEM)为 500;气帘气(CUR)压力为 40psi;雾化气(Gas1)压力为55psi;辅助气(Gas2)压力为 50psi;离子源气体为空气,碰撞气体为高纯度氮气(纯度 99.99%),该气体由 Peak Scientific(英国)氮气发生器提供.1.2.4 数据处理与结果计算 采用 Multiquant V3.0.3 软件和 Microsoft Excel 2019软件进行试验数据分析,Origin 2018软件绘制目标化合物的色谱图.果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素含量按下式计
13、算:/XVm,式中:X 为试样中恩镰孢菌素和白僵菌素的相对含量,gkg1;52 宁波大学学报(理工版)2023 为从基质外标法定量中得到试样测定液中恩镰孢菌素和白僵菌素的质量浓度,gL1;V 为试样测定液最终定容体积,mL;m 为试样质量,g.2 结果与分析结果与分析 2.1 色谱条件的选择及优化色谱条件的选择及优化 2.1.1 色谱条件的优化 流动相选择需与目标化合物的信号响应值、分离程度和离子化效果等因素密切相关.在 ESI+模式下,水相中加入少量乙酸铵可以促进部分化合物的电离效果,提高灵敏度以及改善峰型等22.本文以甲醇为有机相,比较 2mmolL1和 5mmolL1乙酸铵水溶液作为水相
14、时的分离效果,结果表明,当水相为 2mmolL1乙酸铵水溶液时,4 种恩镰孢菌素和白僵菌素分离效果更好,响应值更高.2.1.2 质谱条件的优化 分别配制浓度为1.0mgL1ENA、ENA1、ENB、ENB1 和 BEA 的标准溶液.全扫描模式下,当目标化合物的单标进入离子源内部后,进行一级质谱扫描,获得目标化合物在质谱仪上的母离子和质荷比(m/z).随后进行子离子扫描,调节不同数值的碰撞能量,选择 2 个丰度最高、最稳定的子离子为定性、定量离子.最后在多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)下,优化去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)在质谱仪上的最佳参数
15、.优化后的具体参数见表 2.2.2 样品前处理方法优化样品前处理方法优化 2.2.1 提取溶剂 经查阅文献,水果类基质中真菌毒素的提取多以乙腈体系为主,加入适量的水可以促进有机溶剂在基质中的渗透,而酸的加入可以破坏基质中存在的糖和蛋白质等13,23.在此基础上,本文考察了 V(乙腈):V(水)混合液(80:20)(混合液)、V(乙腈):V(水):V(乙酸)混合液(79:20:1)(混合液)、V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(79:20:1)(混合液)、V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(78:20:2)(混合液)以及V(乙腈):V(水):V(甲酸)混合液(77:20:3)(混合液)为
16、提取液,研究对果汁中4种ENNS和BEA添加回收率的影响.实验结果表明(图 1),5 种提取液对ENA、ENA1 和 BEA 差异不显著(P0.05),添加回收率 88.3%118.6%;混合液对 ENB 和 ENB1 存 表 2 恩镰孢菌素和白僵菌素质谱参数 真菌毒素 母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电 压/V 碰撞能量/eV 保留时间/min ESI扫描方式 ENA 699.4 682.3*40 23.5 7.36 ESI+228.1 40 39.0 ENA1 668.6 210.2*125 29.1 7.27 ESI+541.2 125 30.2 ENB 657.4 640.3*40
17、 24.1 7.08 ESI+196.1 40 39.6 ENB1 654.7 196.2*100 35.6 7.17 ESI+210.2 100 30.2 BEA 801.3 784.5*50 23.3 7.15 ESI+243.9 50 39.0 注:*为定量离子.在明显基质干扰现象,添加回收率分别为 125.5%和 132.7%,且与混合液、混合液和混合液对ENB和ENB1添加回收率的影响差异显著(P0.05),添加回收率在 92.6%118.6%之间.因此,本文确定混合液为提取溶剂.图 1 提取溶剂对恩镰孢菌素和白僵菌素回收率的 影响(加标相对质量浓度 100 gkg1)第 6 期 邓
18、涛,等:效液相色谱-串联质谱法测定果汁中恩镰孢菌素和白僵菌素 53 2.2.2 提取溶剂体积 提取溶剂体积与待测样品之间的接触面积、溶解和扩散程度等都与样品基质中真菌毒素的提取效果间存在一定相关性.因此,本文比较了15、20、25mL的提取溶剂体积对5g果汁样品中4种ENNS和 BEA 的提取效果.实验结果表明(图 2),提取溶剂体积对 BEA 的提取效果呈上升趋势,当体积为15、20、25mL时,BEA的添加回收率分别为68.5%、77.0%、102.7%.4 种 ENNS在 3 种提取溶剂体积下的添加回收率为 99.2%121.4%,差异不显著(P 0.05).最终确定提取溶剂体积为 25
19、mL.图 2 提取液体积对恩镰孢菌素和白僵菌素回收率的 影响(加标相对质量浓度 100 gkg1)2.2.3 果胶酶用量 鉴于果汁中通常会存在悬浮的果胶固体,并且有部分果胶固体还会与真菌毒素相结合,造成难以被有机溶剂提取24.但果胶酶可以将果胶和淀粉等复杂的多糖分解成简单小分子,还能将真菌毒素从植物组织中释放出来,提高提取效果.因此,本文比较 150、200、250L 果胶酶用量对果汁中4种ENNS和BEA添加回收率的影响.实验结果表明(图 3),3 种果胶酶用量对 4 种 ENNS的影响较小,添加回收率在 92.6%110.6%之间;但果胶酶用量为 150L 时,BEA 添加回收率为 72.
20、8%,当果胶酶用量为 200L 和 250L 时,添加回收率增加了29.9%和35.1%,且与前者差异显著(P0.01).最终选择果胶酶用量为 200L.2.2.4 盐析剂 QuEChERS 方法一般会加入盐,通过盐析作用去除提取溶剂中水分,降低有机相在水中的溶解度20.本文以 4g 无水 MgSO4+1g NaCl、4g 无水MgSO4+0.5g 无水 CH3COONa+0.5g NaCl 为盐析剂,比较2种盐析剂对果汁中4种ENNS和BEA添加回收率的影响.实验结果表明(图 4),2 种盐析剂对 4 种 ENNS影响较小,添加回收率为 92.6%112.6%;但4g无水MgSO4+0.5g
21、无水CH3COONa+0.5g NaCl 为盐析剂时,BEA 的添加回收率为102.7%,比4g无水MgSO4+1g NaCl为盐析剂时的BEA添加回收率增加30.6%,且两者之间差异显著(P0.01).最终本文选择盐析剂为4g无水MgSO4+0.5g 无水 CH3COONa+0.5g NaCl.图 4 盐析剂选择对恩镰孢菌素和白僵菌素回收率的 影响(加标相对质量浓度 100 gkg1)2.2.5 净化剂 由于食品基质的复杂性,QuEChERS 方法在样品盐析后,通常用石墨化炭黑、乙二胺-N-丙基硅烷和碳 18(carbon 18,C18)等净化剂去除色素、有机酸和果胶等杂质20.因此,本文比
22、较 0、100、200、图 3 果胶酶用量对恩镰孢菌素和白僵菌素回收率影响的 影响(加标相对质量浓度 100 gkg-1)54 宁波大学学报(理工版)2023 300mg 的 C18 净化剂对果汁中 4 种 ENNS和 BEA添加回收率的影响.实验结果表明(图 5),未净化的 4 种恩镰孢菌素和白僵菌素的添加回收率在67.3%83.6%之间,存在明显的基质干扰现象,且与加入 100、200、300mg 用量的 C18 净化后的添加回收率差异显著(P0.05).最终本文选择 C18 净化剂的用量为 100mg.图 5 C18 用量对恩镰孢菌素和白僵菌素添加回收率的 影响(加标相对质量浓度 100
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