高同型半胱氨酸通过Notch1_Hes1信号通路促进HT22细胞自噬和凋亡.pdf
《高同型半胱氨酸通过Notch1_Hes1信号通路促进HT22细胞自噬和凋亡.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《高同型半胱氨酸通过Notch1_Hes1信号通路促进HT22细胞自噬和凋亡.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、高同型半胱氨酸血症(HHcy)是人类最常见的代谢异常之一 1-3,损害老年人、携带者和神经退行性疾病患者的认知和神经功能1,4,5,是痴呆的一个独立危险因素 4,6,7。除此之外,HHcy也与高血压、糖尿病等心血管和代谢性疾病有关 1,4,6,HHcy也是2型糖尿病患者发生微血管病变的独立危险因素 6,8。了解HHcy所致损伤及其分子机制,将有助于HHcy所致疾病的预防和治疗 6,8。HHcy导致认知功能和神经功能损伤的机制尚不清楚 9,10。研究提示 10-12,HHcy具有兴奋性神经毒性作用,通过激活NMDA受体或减少突触前膜对谷氨酸再摄取,引发谷氨酸的兴奋性毒性,导致脑损害的发生 13,
2、14。HHcy导致DNA甲基化异常 15,16,诱导细胞凋亡 17,18。Hes(hes)基因家族包括Hes1Hes7七个同源高同高同型半胱氨酸通过型半胱氨酸通过NotchNotch1 1/HesHes1 1信号通路促进信号通路促进HTHT2222细胞自噬细胞自噬和凋和凋亡亡张竞文1,何 静2,米晓娟1,许贤瑞2,田 英1,燕 茹2宁夏医科大学1基础医学院/国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室,2总医院,宁夏 银川 750004High homocysteine level promotes autophagy and apoptosis of mouse hippocampalH
3、T22 cells through the Notch1/Hes1 signaling pathwayZHANG Jingwen1,HE Jing2,MI Xiaojuan1,XU Xianrui2,TIAN Ying1,YAN Ru21School of Basic Medical Sciences,NHC Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2General Hospital of Ningxia Medic
4、al University,Yinchuan 750004,China摘要:目的 探讨高同型半胱氨酸(HHcy)引起神经细胞损伤的相关机制。方法 采用HT22细胞,分为空白对照组(简称0组),高同型半胱氨酸组(Hcy 100 mol/L,简称100组),高同型半胱氨酸维生素B干预组(Hcy 100 mol/L+叶酸+维生素B12,简称100+fv组),空白对照+叶酸+维生素B12组(简称0+fv组)。通过透射电镜和流式细胞术观察自噬及凋亡;Western blotting、Real-time PCR 检测Hes1、Hes5、Notch1、Jagged1、Bcl-2、Bax、P62、LC3II/
5、LC3I表达。结果 培养48 h后,高同型半胱氨酸组(100组)中死亡细胞明显增加(P0.05)。流式细胞检测结果显示,高同型半胱氨酸组凋亡细胞比例均高于0组、100+fv组和0+fv组(P0.05)。透射电镜观察显示,在高同型半胱氨酸组,线粒体肿胀、空泡化,自噬体增加。Western blot显示,在高同型半胱氨酸组,Bax/Bcl-2比值明显高于对照组和100+fv组(P0.05);P62相对值明显低于对照组(P0.05);LC3II/LC3I比值明显高于对照组和100+fv组(P0.05);HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达明显低于对照组(P0.05)。Real-t
6、ime PCR 检测结果显示,在高同型半胱氨酸组,LC3 mRNA、Beclin1 mRNA明显高于对照组和100+fv组,P62mRNA明显低于100+fv组(P0.05);Hes1mRNA和Hes5 mRNA明显低于对照组、100+fv组和0+fv组(P0.05)。结论 高同型半胱氨酸能诱导HT22细胞自噬和凋亡增加,伴有Hes1和Jagged1基因表达下调。关键词:同型半胱氨酸;细胞;自噬;凋亡;Notch1;HES1;Jagged1Abstract:Objective To explore the mechanism of neuronal injury caused by hyper
7、homocysteinemia.Methods Mousehippocampal HT22 cells were treated with homocysteine(Hcy,100 mol/L),Hcy+folic acid+vitamin B12(100+fv group)or folicacid+vitamin B12(0+fv group),and the changes in cell autophagy and apoptosis were detected using transmission electronmicroscope(TEM)and flow cytometry.Th
8、e expressions of Hes1,Hes5,Notch1,Jagged1,Bcl-2,Bax,P62 and LC3 in the treatedcells were detected with Western blotting and real-time PCR.Results Treatment with Hcy for 48 h significantly increased thenumber of dead cells in HT22 cell cultures.Flow cytometry showed that the percentage of apoptotic c
9、ells was significantlyhigher in cells treated with Hcy alone than in other treatment groups(P0.05).TEM revealed obvious mitochondrial swellingand vacuolation and increased autophagy in Hcy-treated cells.Western blotting showed that the Bax/Bcl-2 ratio wassignificantly higher in Hcy-treated cells tha
10、n in the blank control cells and cells in 100+fv group(P0.05).The Hcy-treated cellsshowed a significantly lower relative expression of P62 than the blank control cells(P0.05),a higher LC3II/LC3I ratio than thecells in the blank control and 100+fv groups(P0.05),and lower expressions of HES1,HES5,Notc
11、h1 and Jagged1 proteins thanthe blank control cells(P0.05).Conclusion High Hcy levels promote autophagy andapoptosis and down-regulate Hes1 and Jagged1 expressions in HT22 cells.Keywords:homocysteine;hippocampal neurons;autophagy;apoptosis;Notch1;Hes1;Jagged1收稿日期:2023-04-17基金项目:宁夏回族自治区重点研发项目(2019BEG
12、03006);宁夏回族自治区自然科学基金(2022AAC03192)作者简介:张竞文,博士,副教授,E-mail:通信作者:燕 茹,硕士,主治医师,E-mail:doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.10.19J South Med Univ,2023,43(10):1796-18031796基因,可分为激活型、抑制型两大类 19。Hes1、Hes5属于抑制型基因,具有特征性的碱性螺旋-环-螺旋 20,Notch信号通路调节Hes1、Hes5的表达 20,21。Hes1、Hes3和Hes5调节神经干细胞的增殖和分化 19,21。前期动物实验研究可见,HHcy可降
13、低嗅球和大脑神经元HES1 和 HES5 的表达 18,22。但是,HHcy 是否通过Notch1/Hes1信号通路参与自噬和凋亡调节尚不清楚。根据microRNA基因芯片测序分析可见,Notch信号通路为差异miRNA富集的候选通路之一,同型半胱氨酸可作用于细胞凋亡、自噬、生长等 5,11,13。本研究将以HT22小鼠海马神经元细胞系作为研究对象,采用同型半胱氨酸进行共培养,制备高同型半胱氨酸血症体外模型。通过细胞学、电子显微镜、流式细胞术、Westernblot、Real-time PCR等技术,检测 Hes1、Hes5、Jagged1、Notch1、Bcl-2、Bax、P62、LC3I、
14、LC3II 的表达,探讨HHcy对神经细胞自噬和凋亡的影响及其Notch1/Hes1信号通路的作用。1 材料和方法1.1 材料全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、BCA试剂盒、5电泳上样缓冲液、蛋白 marker等(凯基生物)。兔抗Hes1、兔抗Hes5、兔抗Jagged1、兔抗Notch1、兔抗 bax、兔抗 bcl2(Abcam),多克隆抗 P62(Cellsignal)、Beclin-1(Proteintech)、LC3(Proteintech),-actin、CCK8等(康为世纪生物)。HT22细胞(Procell)由宁夏颅脑疾病重点实验室-国家重点实验室培育基地馈赠。同型
15、半胱氨酸(Hcy)、叶酸(Folic acid)、维生素B12(Sigma)等(国药集团)。应用Primer8.3 软件设计针对Hes1等 mRNA的引物探针。Primer3 网址:http:/www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/Primer3,BLAST网址:http:/www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。引 物 顺 序 为(5-3,3-5)。GAPDH:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG,TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT;Hes1:CACGACACCGGACAAACCA,GAGGTGCTTCACAGTCATT
16、TCCA;Hes5:TACCTGAAACACAGCAAAGCCT,GGCCGCTGGAAGTGGTAAA;Notch1:CTTCGTGCTCCTGTTCTTTGTG,TCTTCGTCTCCCCACTCGTTCT;Jagged1:TCTACATAGCCTGTGAGCCTTCC,TCACCAAGCAACAGACCCAAG;P62:GACAAGAGTAACACTCAGCCAAGCA,TCCATCTGTTCCTCTGGCTGTC;LC3:ATCATCGAGCGCTACAAGGG,AGCCGAAGGTTTCTTGGGAG;beclin 1:GAGATTGGACCAGGAGGAAGCT,GTGCCAAAC
17、TGTCCGCTGTG;Bcl2:TGACTTCTCTCGTCGCTACCGT,CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC;Bax:GCCTTTTTGCTACAGGGTTTCAT,TATTGCTGTCCAGTTCATCTCCA;-actin:GCTGTCCCTDTATGCCTCTG,TTTGATGTCACGCACGATTT。引物由上海生工生物公司提供。1.2 方法1.2.1 细胞培养 细胞复苏后,接种于培养瓶内贴壁生长,置于37,5%CO2培养箱常规培养,培养液隔24 h更换。长至70%80%时,制备细胞悬液传代培养。选择34代的细胞用于后续实验。采用CCK8试剂盒,检测细胞活力。1.2.2
18、 Hcy作用浓度筛选 Hcy浓度设定为0、20、50、100、200、500mol/L。根据CCK8检测结果,Hcy100mol/L为最适浓度,培养48 h为最适时间。依此,本实验分组为:空白对照组(简称0组),高同型半胱氨酸组(简称100组),Hcy 100 mol/L;高同型半胱氨酸维生素B干预组(简称100+fv组),Hcy 100 mol/L+叶酸+维生素B12;空白对照+叶酸+维生素B12组(简称0+fv组)。1.2.3 筛选Hes1 siRNA 将Hes1 siRNA干扰序列转染HT22细胞,培养48 h后,western blot检测Hes1蛋白表达,qPCR检测Hes1 mRN
19、A水平。所用3条片段:si-Hes1-373、si-Hes1-1227、si-Hes1-1292。根据 Westernblot、qPCR检测的结果,筛选出最优的Hes1 siRNA片段为si-Hes1-1292。其序列为:sense GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG,antisense AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG。1.2.4 Hes1重组质粒构建 以小鼠cDNA为模板,PCR扩增 Hesl 基因,上下游引物分别为 5-GCCGATATCGCCACCATGCCAGCTGATATAATGGA-3和5-TAACTCGAGGC TCTCAGTTCCGCCACGGTCT-3,目
20、的片段约861 bp。将穿梭载体pAd-Track用EcoRV和Xho I双酶切后获得的骨架片段与Hes1基因片段连接,经测序验证,获得携带Hes1的质粒。限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切,酶切片段为3720 bp和6182 bp,5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.5 Real-time PCR 采用Trizol 试剂盒提取总RNA,逆转录 cDNA合成,逆转录的反应体系总体积25 L,42 1 h,70 5 min,已合成的 cDNA放入-20 冰箱保存。检测PCR 扩增产物;PCR 反应液置于 FTC-3000 实时定量荧光Real-time PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。计
21、算机系统自动记录荧光信号,用Ct法统计:A=Ct=Ct(待测样本目的基因)-Ct(待测样本内参基因);B=Ct(对照样本目的基因)-Ct(对照样本内标基因);K=Ct=A-B;表达倍数变化=2-K1.2.6 Hes1 siRNA转染细胞转染细胞按说明书操作。取对数增殖期的细胞,按照每孔8105/孔平铺在6http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1796-18031797孔板,稳定培养24 h;Lipofectamine 2000分别与对应siRNA预混配置成工作液,100 nmol/L,室温孵育25min;待细胞生长融合度约50%时,更换siRNA预混
22、工作液,继续37 孵育1 d后更换含血清培养液,继续培养12 d;收集细胞,Western blot检测各组Hes1蛋白表达,筛选出最优的Hes1干扰片段。1.2.7 统计分析 采用 SPSS 20.0 软件分析。Students检验和SNK检验,进行不同分组之间的两两比较,以P0.05时认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 细胞生长情况培养48 h可见,各组细胞生长状况接近,细胞比较丰富(图1)。空白对照组(0组)胞体丰满、不规则形,片状生长,细胞可见突起(图1A)。高同型半胱氨酸组(100组)中死亡细胞明显增加(图1B),高同型半胱氨酸维生素B干预组(100+fv组,图1C)和维生素B组
23、(0+fv组)可见少量死亡细胞(图1D)。图1 HT22细胞生长情况Fig.1 Growth of HT22 cells in different groups.A:Scattered dead cells in blank control group.B:Increased dead cells in 100 mol/L Hcy-treated cells.C:Scattered dead cells in 100+fv group.D:Scattereddeadcellsin0+fvgroup.Scalebar=50m.ABCD2.2 细胞凋亡培养48 h后,Annexin V-FITC/
24、PI流式细胞检测结果可见(图2),分别与0组(图2A)、100+fv组(图2C)和0+fv组(图2D)比较,高同型半胱氨酸组(图2B)凋亡细胞的比例均明显升高(图2E);与高同型半胱氨酸组比较,100+fv组和0+fv组凋亡细胞比例明显降低(图2E)。2.3 超微结构变化透射电子显微镜观察可见,培养48 h,对照组细胞结构完整,线粒体、内质网等细胞器形态正常(图3A);在Hcy 100 mol/L组,细胞结构基本完整,细胞质明显水肿淡染,线粒体肿胀、空泡化,可见多个自噬体(图3B);在100+fv组,也可见线粒体肿胀、空泡化、自噬体,但程度轻于Hcy 100 mol/L组(图3C);在100+
25、fv组,偶见自噬体(图3D)。2.4 Westernblot结果Westernblot结果显示(图4),在Hcy100mol/L组,Bax表达增加,Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值明显高于0组和100+fv组(P0.05);P62相对值在Hcy100mol/L组明显低于对照组(图4,P0.05),LC3II/LC3I比值在Hcy 100 mol/L 组高于 0 组和 100+fv 组(P0.05);Beclin1在Hcy100mol/L组未见明显变化(图4)。HES1、HES5、Notch1 和 Jagged1 蛋 白 Westernblot 结果可见(图 5),在 Hcy100 m
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 半胱氨酸 通过 Notch1_Hes1 信号 通路 促进 HT22 细胞
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。