高同型半胱氨酸通过Notch1_Hes1信号通路促进HT22细胞自噬和凋亡.pdf

高同型半胱氨酸血症（HHcy）是人类最常见的代谢异常之一 1-3，损害老年人、携带者和神经退行性疾病患者的认知和神经功能1,4,5，是痴呆的一个独立危险因素 4,6,7。除此之外，HHcy也与高血压、糖尿病等心血管和代谢性疾病有关 1,4,6，HHcy也是2型糖尿病患者发生微血管病变的独立危险因素 6,8。了解HHcy所致损伤及其分子机制，将有助于HHcy所致疾病的预防和治疗 6,8。HHcy导致认知功能和神经功能损伤的机制尚不清楚 9,10。研究提示 10-12，HHcy具有兴奋性神经毒性作用，通过激活NMDA受体或减少突触前膜对谷氨酸再摄取，引发谷氨酸的兴奋性毒性，导致脑损害的发生 13,14。HHcy导致DNA甲基化异常 15,16，诱导细胞凋亡 17,18。Hes（hes）基因家族包括Hes1Hes7七个同源高同高同型半胱氨酸通过型半胱氨酸通过NotchNotch1 1/HesHes1 1信号通路促进信号通路促进HTHT2222细胞自噬细胞自噬和凋和凋亡亡张竞文1，何 静2，米晓娟1，许贤瑞2，田 英1，燕 茹2宁夏医科大学1基础医学院/国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，2总医院，宁夏 银川 750004High homocysteine level promotes autophagy and apoptosis of mouse hippocampalHT22 cells through the Notch1/Hes1 signaling pathwayZHANG Jingwen1,HE Jing2,MI Xiaojuan1,XU Xianrui2,TIAN Ying1,YAN Ru21School of Basic Medical Sciences,NHC Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China摘要：目的 探讨高同型半胱氨酸（HHcy）引起神经细胞损伤的相关机制。方法 采用HT22细胞，分为空白对照组（简称0组），高同型半胱氨酸组（Hcy 100 mol/L，简称100组），高同型半胱氨酸维生素B干预组（Hcy 100 mol/L+叶酸+维生素B12，简称100+fv组），空白对照+叶酸+维生素B12组（简称0+fv组）。通过透射电镜和流式细胞术观察自噬及凋亡；Western blotting、Real-time PCR 检测Hes1、Hes5、Notch1、Jagged1、Bcl-2、Bax、P62、LC3II/LC3I表达。结果 培养48 h后，高同型半胱氨酸组（100组）中死亡细胞明显增加（P0.05）。流式细胞检测结果显示，高同型半胱氨酸组凋亡细胞比例均高于0组、100+fv组和0+fv组（P0.05）。透射电镜观察显示，在高同型半胱氨酸组，线粒体肿胀、空泡化，自噬体增加。Western blot显示，在高同型半胱氨酸组，Bax/Bcl-2比值明显高于对照组和100+fv组（P0.05）；P62相对值明显低于对照组（P0.05）；LC3II/LC3I比值明显高于对照组和100+fv组（P0.05）；HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达明显低于对照组（P0.05）。Real-time PCR 检测结果显示，在高同型半胱氨酸组，LC3 mRNA、Beclin1 mRNA明显高于对照组和100+fv组，P62mRNA明显低于100+fv组（P0.05）；Hes1mRNA和Hes5 mRNA明显低于对照组、100+fv组和0+fv组（P0.05）。结论 高同型半胱氨酸能诱导HT22细胞自噬和凋亡增加，伴有Hes1和Jagged1基因表达下调。关键词：同型半胱氨酸；细胞；自噬；凋亡；Notch1；HES1；Jagged1Abstract:Objective To explore the mechanism of neuronal injury caused by hyperhomocysteinemia.Methods Mousehippocampal HT22 cells were treated with homocysteine(Hcy,100 mol/L),Hcy+folic acid+vitamin B12(100+fv group)or folicacid+vitamin B12(0+fv group),and the changes in cell autophagy and apoptosis were detected using transmission electronmicroscope(TEM)and flow cytometry.The expressions of Hes1,Hes5,Notch1,Jagged1,Bcl-2,Bax,P62 and LC3 in the treatedcells were detected with Western blotting and real-time PCR.Results Treatment with Hcy for 48 h significantly increased thenumber of dead cells in HT22 cell cultures.Flow cytometry showed that the percentage of apoptotic cells was significantlyhigher in cells treated with Hcy alone than in other treatment groups(P0.05).TEM revealed obvious mitochondrial swellingand vacuolation and increased autophagy in Hcy-treated cells.Western blotting showed that the Bax/Bcl-2 ratio wassignificantly higher in Hcy-treated cells than in the blank control cells and cells in 100+fv group(P0.05).The Hcy-treated cellsshowed a significantly lower relative expression of P62 than the blank control cells(P0.05),a higher LC3II/LC3I ratio than thecells in the blank control and 100+fv groups(P0.05),and lower expressions of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1 proteins thanthe blank control cells(P0.05).Conclusion High Hcy levels promote autophagy andapoptosis and down-regulate Hes1 and Jagged1 expressions in HT22 cells.Keywords:homocysteine;hippocampal neurons;autophagy;apoptosis;Notch1;Hes1;Jagged1收稿日期：2023-04-17基金项目：宁夏回族自治区重点研发项目（2019BEG03006）；宁夏回族自治区自然科学基金（2022AAC03192）作者简介：张竞文，博士，副教授，E-mail:通信作者：燕 茹，硕士，主治医师，E-mail:doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.10.19J South Med Univ,2023,43(10):1796-18031796基因，可分为激活型、抑制型两大类 19。Hes1、Hes5属于抑制型基因，具有特征性的碱性螺旋-环-螺旋 20，Notch信号通路调节Hes1、Hes5的表达 20,21。Hes1、Hes3和Hes5调节神经干细胞的增殖和分化 19,21。前期动物实验研究可见，HHcy可降低嗅球和大脑神经元HES1 和 HES5 的表达 18,22。但是，HHcy 是否通过Notch1/Hes1信号通路参与自噬和凋亡调节尚不清楚。根据microRNA基因芯片测序分析可见，Notch信号通路为差异miRNA富集的候选通路之一，同型半胱氨酸可作用于细胞凋亡、自噬、生长等 5,11,13。本研究将以HT22小鼠海马神经元细胞系作为研究对象，采用同型半胱氨酸进行共培养，制备高同型半胱氨酸血症体外模型。通过细胞学、电子显微镜、流式细胞术、Westernblot、Real-time PCR等技术，检测 Hes1、Hes5、Jagged1、Notch1、Bcl-2、Bax、P62、LC3I、LC3II 的表达，探讨HHcy对神经细胞自噬和凋亡的影响及其Notch1/Hes1信号通路的作用。1 材料和方法1.1 材料全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、BCA试剂盒、5电泳上样缓冲液、蛋白 marker等（凯基生物）。兔抗Hes1、兔抗Hes5、兔抗Jagged1、兔抗Notch1、兔抗 bax、兔抗 bcl2（Abcam），多克隆抗 P62（Cellsignal）、Beclin-1（Proteintech）、LC3（Proteintech），-actin、CCK8等（康为世纪生物）。HT22细胞（Procell）由宁夏颅脑疾病重点实验室-国家重点实验室培育基地馈赠。同型半胱氨酸（Hcy）、叶酸（Folic acid）、维生素B12（Sigma）等（国药集团）。应用Primer8.3 软件设计针对Hes1等 mRNA的引物探针。Primer3 网址：http:/www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/Primer3，BLAST网址：http:/www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。引 物 顺 序 为(5-3,3-5)。GAPDH:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG,TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT;Hes1:CACGACACCGGACAAACCA,GAGGTGCTTCACAGTCATTTCCA;Hes5:TACCTGAAACACAGCAAAGCCT,GGCCGCTGGAAGTGGTAAA;Notch1:CTTCGTGCTCCTGTTCTTTGTG,TCTTCGTCTCCCCACTCGTTCT;Jagged1:TCTACATAGCCTGTGAGCCTTCC,TCACCAAGCAACAGACCCAAG;P62:GACAAGAGTAACACTCAGCCAAGCA,TCCATCTGTTCCTCTGGCTGTC;LC3:ATCATCGAGCGCTACAAGGG,AGCCGAAGGTTTCTTGGGAG;beclin 1:GAGATTGGACCAGGAGGAAGCT,GTGCCAAACTGTCCGCTGTG;Bcl2:TGACTTCTCTCGTCGCTACCGT,CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC;Bax:GCCTTTTTGCTACAGGGTTTCAT,TATTGCTGTCCAGTTCATCTCCA;-actin:GCTGTCCCTDTATGCCTCTG,TTTGATGTCACGCACGATTT。引物由上海生工生物公司提供。1.2 方法1.2.1 细胞培养 细胞复苏后，接种于培养瓶内贴壁生长，置于37，5%CO2培养箱常规培养，培养液隔24 h更换。长至70%80%时，制备细胞悬液传代培养。选择34代的细胞用于后续实验。采用CCK8试剂盒，检测细胞活力。1.2.2 Hcy作用浓度筛选 Hcy浓度设定为0、20、50、100、200、500mol/L。根据CCK8检测结果，Hcy100mol/L为最适浓度，培养48 h为最适时间。依此，本实验分组为：空白对照组（简称0组），高同型半胱氨酸组（简称100组），Hcy 100 mol/L；高同型半胱氨酸维生素B干预组（简称100+fv组），Hcy 100 mol/L+叶酸+维生素B12；空白对照+叶酸+维生素B12组（简称0+fv组）。1.2.3 筛选Hes1 siRNA 将Hes1 siRNA干扰序列转染HT22细胞，培养48 h后，western blot检测Hes1蛋白表达，qPCR检测Hes1 mRNA水平。所用3条片段：si-Hes1-373、si-Hes1-1227、si-Hes1-1292。根据 Westernblot、qPCR检测的结果，筛选出最优的Hes1 siRNA片段为si-Hes1-1292。其序列为：sense GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG，antisense AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG。1.2.4 Hes1重组质粒构建 以小鼠cDNA为模板，PCR扩增 Hesl 基因，上下游引物分别为 5-GCCGATATCGCCACCATGCCAGCTGATATAATGGA-3和5-TAACTCGAGGC TCTCAGTTCCGCCACGGTCT-3，目的片段约861 bp。将穿梭载体pAd-Track用EcoRV和Xho I双酶切后获得的骨架片段与Hes1基因片段连接，经测序验证，获得携带Hes1的质粒。限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，酶切片段为3720 bp和6182 bp，5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.5 Real-time PCR 采用Trizol 试剂盒提取总RNA，逆转录 cDNA合成，逆转录的反应体系总体积25 L，42 1 h，70 5 min，已合成的 cDNA放入-20 冰箱保存。检测PCR 扩增产物；PCR 反应液置于 FTC-3000 实时定量荧光Real-time PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。计算机系统自动记录荧光信号，用Ct法统计：A=Ct=Ct（待测样本目的基因）-Ct（待测样本内参基因）；B=Ct（对照样本目的基因）-Ct（对照样本内标基因）；K=Ct=A-B；表达倍数变化=2-K1.2.6 Hes1 siRNA转染细胞转染细胞按说明书操作。取对数增殖期的细胞，按照每孔8105/孔平铺在6http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1796-18031797孔板，稳定培养24 h；Lipofectamine 2000分别与对应siRNA预混配置成工作液，100 nmol/L，室温孵育25min；待细胞生长融合度约50%时，更换siRNA预混工作液，继续37 孵育1 d后更换含血清培养液，继续培养12 d；收集细胞，Western blot检测各组Hes1蛋白表达，筛选出最优的Hes1干扰片段。1.2.7 统计分析 采用 SPSS 20.0 软件分析。Students检验和SNK检验，进行不同分组之间的两两比较，以P0.05时认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 细胞生长情况培养48 h可见，各组细胞生长状况接近，细胞比较丰富（图1）。空白对照组（0组）胞体丰满、不规则形，片状生长，细胞可见突起（图1A）。高同型半胱氨酸组（100组）中死亡细胞明显增加（图1B），高同型半胱氨酸维生素B干预组（100+fv组，图1C）和维生素B组（0+fv组）可见少量死亡细胞（图1D）。图1 HT22细胞生长情况Fig.1 Growth of HT22 cells in different groups.A:Scattered dead cells in blank control group.B:Increased dead cells in 100 mol/L Hcy-treated cells.C:Scattered dead cells in 100+fv group.D:Scattereddeadcellsin0+fvgroup.Scalebar=50m.ABCD2.2 细胞凋亡培养48 h后，Annexin V-FITC/PI流式细胞检测结果可见（图2），分别与0组（图2A）、100+fv组（图2C）和0+fv组（图2D）比较，高同型半胱氨酸组（图2B）凋亡细胞的比例均明显升高（图2E）；与高同型半胱氨酸组比较，100+fv组和0+fv组凋亡细胞比例明显降低（图2E）。2.3 超微结构变化透射电子显微镜观察可见，培养48 h，对照组细胞结构完整，线粒体、内质网等细胞器形态正常（图3A）；在Hcy 100 mol/L组，细胞结构基本完整，细胞质明显水肿淡染，线粒体肿胀、空泡化，可见多个自噬体（图3B）；在100+fv组，也可见线粒体肿胀、空泡化、自噬体，但程度轻于Hcy 100 mol/L组（图3C）；在100+fv组，偶见自噬体（图3D）。2.4 Westernblot结果Westernblot结果显示（图4），在Hcy100mol/L组，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2比值明显高于0组和100+fv组（P0.05）；P62相对值在Hcy100mol/L组明显低于对照组（图4，P0.05），LC3II/LC3I比值在Hcy 100 mol/L 组高于 0 组和 100+fv 组（P0.05）；Beclin1在Hcy100mol/L组未见明显变化(图4)。HES1、HES5、Notch1 和 Jagged1 蛋 白 Westernblot 结果可见（图 5），在 Hcy100 mol/L 组，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达比值明显低于对照组（P0.05），100+fv 组明显高于 Hcy 100 mol/L 组（图5，P0.05）。2.5 Real-timePCR 检测结果从P62、LC3、Beclin1的mRNA扩增结果可见（图6），Hcy 100 mol/L组LC3、Beclin1的mRNA明显高于0组和0+fv组，P62明显低于100+fv组（P0.05），LC3和Beclin1的mRNA在高同型半胱氨酸组与100+fv组之间无显著性差异（图6D）。HT22细胞Real-time PCR 检测结果显示，在培养48 h，高同型半胱氨酸组Hes1和Hes5 mRNA明显减少J South Med Univ,2023,43(10):1796-1803http:/www.j-1798（图7），与0组、100+fv组 和0+fv组比较，差异均有显著性意义（图7E，P0.05）；高同型半胱氨酸组Jagged1无明显变化，100+fv组Hes1 mRNA明显高于高同型半胱氨酸组（图7E，P0.05）。2.6 Hcy对过表达和干扰Hes1后的影响Western blot检测可见，加入Hes1干扰和过表达后，目标蛋白均有一定的变化（图8A）。Hcy组、Hes1siRNA组和Hcy+Hes1siRNA组Hes1表达量明显低于对照组，且Hcy+Hes1siRNA组又明显低于Hcy组和Hes1 siRNA组（图8B）；而Notch1表达量无显著性差异；Jagged1表达量在Hcy组和Hcy+Hes1siRNA组明显降低，而Hes1 siRNA组高于Hcy组和Hcy+Hes1siRNA组（图8B）。3 讨论高同型半胱氨酸血症（HHcy）与神经和精神健康的CDAFL2-AFL2-AFL2-AFL2-AB图2 HT22细胞凋亡检测结果Fig.2 Flow cytometry for detecting cell apoptosisin different groups.A:0 group,B:100 group.C:100+fv group.D:0+fv group.E:Histogram ofapoptotic proportion,*P0.05 vs 0 group;#P0.05vs100group,n=3.Apoptosis rate ofHT22 cells(%)504030201000100100+fv0+fvE*#图3 HT22细胞超微结构Fig.3 Ultrastructure of HT22 cells in different groups.A:Normal mitochondria(M)in 0 group.B:Mitochondrial swelling,vacuolation(V),and increased autophagosome(AS)in 100 group.C:Autophagosomes(AS)in100+fvgroup.D:Autophagosomes(AS)in0+fvgroup.Scalebar=1m.ABCDGrouphttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1796-18031799图4 凋亡和自噬相关蛋白Westernblot结果Fig.4 Western blotting of the proteins related with apoptosis and autophagy in different groups.A:Western blotsof the proteins.B:Bar graph of Bax/Bcl-2 and LC3II/LC3I ratios.C:Bar graph of relative values of P62 and Beclin1.*P0.05vs0group;#P0.05vs100group;n=3.0100100+fv 0+fvBcl-2BaxP62LC3ILC3IIBeclin 1-actin25 00060 00014 00017 00060 00042 000The ratio1.51.00.50.0*#0 group100 group100+fv group0+fv groupBax/Bcl-2LC3II/LC3I*#0 group100 group100+fv group0+fv group1.51.00.50.0The protein/-actinP62Beclin 1图5 HES1、HES5、Notch1和Jagged1westernblot结果Fig.5 Western blotting of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1 proteins in different groups.A:Western blots of the proteins.B-E:Histograms of relative expressions of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1,respectively.*P0.05 vs 0 group;#P0.05 vs 100group;n=3.HES5/-actin0.300.250.200.150.100.0500100100+fv0+fv0100100+fv0+fvNotch1/-actin0.80.60.40.200100100+fv 0+fvHES1HES5Notch1Jagged1-actin30 00018 000125 000134 00042 000Mr0100100+fv0+fvJagged1/-actin0.40.30.20.10HES1/-actin0.40.30.20.100100100+fv0+fvBCDEA#*ABCMrGroupGroupGroupGroupJ South Med Univ,2023,43(10):1796-1803http:/www.j-1800图6 P62和LC3及Beclin1Real-timePCR检测结果Fig.6 Results of real-time PCR of P62,LC3 and Beclin1 mRNAs in different groups.A:P62 mRNA amplificationcurve;B:LC3 mRNA amplification curve;C:Beclin1 mRNA amplification curve;D:Histogram of mRNAamplification;*P0.05vs0group;#P0.05vs100group.Relative mRNAlevelnormalized to-actin1.61.41.21.00.80.60.40.20*#Hes1Hes5Notch1Jagged1E图7 Hes1、Hes5、Notch1和及Jagged1 Real-timePCR检测结果Fig.7 Real-time PCR of Hes1,Hes5,Notch1 andJagged1 in different groups.A:Hes1 mRNAamplification curve;B:Hes5 mRNA amplificationcurve;C:Notch1 mRNA amplification curve;D:Jagged1 amplification curve;E:Histogram ofmRNA amplification;*P0.05 vs 0 group;#P0.05vs100group.ABCDRelative mRNAlevelnormalized to-actin0 group100 group100+fv group0+fv groupP62LC3Beclin13.02.52.01.51.00.50*#ABCDhttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1796-1803*0 group100 group100+fv group0+fv group1801改变有关，如认知障碍、抑郁症、中风和神经退行性疾病 3,19,24。实验研究提示，HHcy能够导致脑组织损伤和神经细胞凋亡 18,22、神经细胞自噬 22,23。本研究显示，在HT22细胞，同型半胱氨酸100 mol/L培养48h后，凋亡细胞的比例明显升高，细胞水肿、线粒体肿胀空泡化、自噬体增加；采用叶酸和维生素B12干预后细胞凋亡比例和细胞自噬明显降低。结果提示，高同型半胱氨酸能够诱导HT22细胞超微结构损伤、自噬上调及细胞凋亡。该结果与前期ApoE-/-高同型半胱氨酸小鼠体内研究基本一致 18,22,25。研究表明，HHcy在体内外均能诱导细胞凋亡 12,22。然而，其中的作用机制尚不清楚。在本研究中，通过Western blot和real-time PCR 检测可见，同型半胱氨酸100 mol/L培养48 h后，Bax基因表达明显增加，而Bcl-2基因表达则明显抑制。结果提示高同型半胱氨酸可通过bax/bcl-2途径引起细胞凋亡。实验研究发现，HHcy诱导小鼠神经细胞凋亡 22,25。在衰老和神经退行性变过程中，可见神经元凋亡和自噬增加 23,26。细胞凋亡增加、储备细胞减少可能是许多疾病共同的致病基础 1,22,27。HHcy能够诱导小鼠神经元自噬和细胞凋亡，从而加重神经元损伤 23,28。作为自噬促进剂，HHcy可诱导大鼠脑缺血再灌注后 LC3b/Beclin-1表达上调，自噬体积累，加重神经元损伤 22,28。本研究结果显示，在同型半胱氨酸100 mol/L组，P62相对值明显低于对照组，LC3II/LC3I比值明显高于对照组和干预组，这些变化与线粒体肿胀、空泡化、自噬体增加相一致。P62蛋白与蛋白质的运输和降解有关，表达下调时，自噬被激活 23,28。关于HHcy引起神经细胞自噬增加的途径和机制尚不清楚 15,16。HHcy 可抑制 S-腺苷甲硫氨酸的生物合成，导致DNA低甲基化，抑制细胞生长 1,15,28。由HHcy引起的多种毒性作用可能与神经元再生耗竭有关 13,25,31。本研究显示，同型半胱氨酸100mol/L处理的HT22细胞，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达降低。提示高同型半胱氨酸可下调 Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1的表达。动物实验研究结果提示，在HHcy所致神经元损伤和认知障碍中，存在HES1和HES5表达降低 18,22,25。在HHcy状态下，对于Notch/Hes/Rbpj信号通路以及 Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1神经元表达下调的意义和机制知之甚少，将需要更多的研究进行证明。Hes1 and Hes5基因是Hes基因家族的主要成员，作为转录激活因子参与神经元分化 20,21。研究提示 27,29,30，Wnt/-catenin和Notch信号通路与神经元干细胞动力学的调节密切相关；在神经干细胞中，Wnt和Notch信号通路参与了hNPCs 的调节 21,27。在 Notch/Rbpj 信号传导通路中起主导作用的 Hes1和 Hes5，在HHcy 小鼠的额叶皮层神经元和大脑中表达下调，可能抑制了Notch/Hes/Rbpj信号通路的作用 22,25,32。Hes1Notch1Jagged1-actin30 000125 000134 00042 000MrHcy+Hesl siRNAHes1 siRNAHcy+Ad-Hes1Ad-Hes1Hcylip2000ControlA图8 Hcy对过表达和干扰Hes1后的影响Fig.8 Effect of Hcy on Hes1,Notch1 andJagged1 expressions in HT22 cells withHes1 overexpression and knockdown.A:Western blots of the proteins.B:Histogramof relative expression levels of the proteins.*P0.05vsconandsi-NCgroups,respectively;#P0.05vsHcygroup;n=3.*#*#Hes1Notch1Jagged1Controllip2000HcyAd-Hes1Hcy+Ad-Hes1Hes1 siRNAHcy+Hesl siRNADifferential cell counts in BAL(1103)1.21.00.80.60.40.20BJ South Med Univ,2023,43(10):1796-1803http:/www.j-1802参考文献：1 Ganguly P,Alam SF.Role of homocysteine in the development ofcardiovasculardisease J .NutrJ,2015,14:6.2 Hiraoka M,Kagawa Y.Genetic polymorphisms and folate status J .CongenitAnomalies,2017,57(5):142-9.3 kovierov H,Vidomanov E,Mahmood S,et al.The molecular andcellular effect of homocysteine metabolism imbalance on humanhealth J .IntJMolSci,2016,17(10):1733.4 Jakubowski H.Homocysteine editing,thioester chemistry,coenzymeA,andtheoriginofcodedpeptidesynthesis J .Life,2017,7(1):6.5 Bonetti F,Brombo G,Zuliani G.The relationship betweenhyperhomocysteinemia and neurodegeneration J .NeurodegenerDisManag,2016,6(2):133-45.6 章琳琪,范天睿,初 明.同型半胱氨酸化与疾病 J .生理科学进展,2019,50(1):1-9.7 Kamat PK,Kyles P,Kalani A,et 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