反复七氟烷暴露对新生大鼠海马细胞凋亡和远期学习记忆能力的影响.pdf
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1、反复七氟烷暴露对新生大鼠海马细胞凋亡和远期学习记忆能力的影响毕小波,张霞,文继鹏,丁委,李进(西南医科大学附属医院 麻醉科,四川 泸州 ;西南医科大学附属医院 新生儿科,四川 泸州 ;成都中医药大学附属医院 麻醉科,四川 成都 )【摘要】目的:探讨反复七氟烷暴露对新生大鼠海马细胞凋亡和远期学习记忆能力的影响及对 通路的调控作用。方法:只 大鼠按随机数字表法分为对照组(的氧气)、次暴露组(出生后第 日吸入 的七氟烷、氧气)、次暴露组(出生后第 、日均吸入 的七氟烷、氧气)、次暴露组(出生后第 、日均吸入 的七氟烷、氧气)、次暴露 (激活剂)组(次吸入七氟烷后腹腔注射 )。水迷宫测定大鼠学习记忆能
2、力;染色、透射电镜观察大鼠海马组织神经元形态及结构变化;检测大鼠海马神经细胞凋亡情况;检测大鼠海马组织凋亡相关蛋白(、)及 通路相关蛋白的表达。结果:与对照组和次暴露组相比,次暴露组和次暴露组大鼠学习记忆能力严重降低,海马组织神经元形态及结构受到严重损害,海马神经细胞凋亡率增加(),海马组织中 、蛋白表达显著升高(),蛋白表达、通路蛋白表达显著降低();随着七氟烷暴露次数的增加,大鼠学习记忆能力显著降低,海马神经元细胞受损严重,海马神经细胞凋亡率显著增加(),通路蛋白表达显著降低();与 次暴露组相比,次暴露 组大鼠学习记忆能力、海马神经元结构得到一定的恢复,海马神经细胞凋亡率、蛋白显著降低(
3、),蛋白表达、通路蛋白表达显著升高()。结论:反复七氟烷暴露可显著降低新生大鼠的学习记忆能力并加重海马神经细胞凋亡,其机制可能是通过抑制 通路发挥作用。【关键词】七氟烷;学习记忆;海马;磷酸肌醇 激酶 蛋白激酶 ;大鼠【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】()【】,(,;,;,)【】:(),(),(,),(,),()();(,):,(),(),(),(),中国应用生理学杂志,()(),(),():,【】;【基金项目】四川省卫生和计划生育委员会科研项目();西南医科大学校级科研项目()【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】:;:随着现代医疗技术的发展,麻醉成为临床手术中常用的安全常规医疗程序之一
4、。新生儿可在麻醉状态下接受手术及一些特殊检查,新生儿脑部未发育成熟,故容易受到外界不良因素的干扰。资料显示麻醉剂的使用不当可导致新生儿发生海马神经元细胞凋亡、脑细胞凋亡等麻醉相关不良事件,进而影响婴幼儿的大脑发育及学习记忆能力,对其造成不可逆的损伤 ,。七氟烷是临床应用广泛的吸入性全身麻醉药,具有易挥发、不易燃、刺激小、见效快、过程平稳、复苏快等特点,在婴幼儿及学龄前儿童麻醉中应用较广泛。资料显示,长期暴露于七氟烷可对新生大鼠产生一定的神经毒性,导致新生大鼠的神经元生长受限,促进大鼠脑细胞凋亡增加,使幼鼠大脑发育受阻 。磷酸肌醇 激酶 蛋白激酶(,)信号通路在细胞增殖、凋亡等生物学活动中发挥重
5、要作用。多项研究表明,信号通路的激活对于抑制脑缺血 再灌注损伤 、异丙酚 导致的海马神经细胞凋亡具有重要意义。研究显示,七氟烷对新生大鼠体内的 信号通路有一定的抑制作用 。但在模拟缺血 再灌注损伤的新生大鼠心肌细胞中,七氟烷能够激活 通路 。基于上述描述,七氟烷对新生大鼠 通路的影响存在争议,对该通路的作用是抑制还是激活仍需进一步探究。本研究重点在于通过联合 通路激活剂深入探讨反复七氟烷暴露影响新生大鼠海马细胞凋亡及学习记忆能力的可能机制,为完善七氟烷影响婴幼儿大脑学习记忆能力的机制提供依据,也为七氟烷能够安全有效地应用于临床麻醉提供理论依据。材料 动物 只 日龄健康 雄性新生大鼠 成都达硕实
6、验动物中心,(川),级,体重 。实验期间所有大鼠均于本院动物房中饲养 (川),期间由母鼠哺乳喂养,动物房温度约 ,相对湿度约 ,保持动物房整洁卫生及鼠笼清洁、透气。在实验过程中按照动物使用的“”原则给予人道主义关怀。本研究通过西南医科大学动物实验伦理委员会的审批(批号:),符合动物伦理学标准。主要试剂及仪器七氟烷(纯度 ,批号:)、(激活剂,批号:)购于上海陶素生化科技有限公司;细胞凋亡检测试剂盒、多聚甲醛(货号:、)购于上海碧云天;高效 裂解液、苏木素染液、染色试剂盒(货号:、)购于北京索莱宝科技有限公司;兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 ()、淋巴细胞瘤 基因()、相关 蛋白()、一抗、羊抗兔
7、二抗(货 号:、)购于 ;生物组织脱水机(型号:)购于孝感市德比电子科技有限公司;倒置显微镜(型号 )购于德国徕卡;透射电镜(型号:)购于美国 ;凝胶成像仪(型号:)购于德国耶拿。动物分组及处理将 只新生大鼠按照随机数字表法分为对照组、次暴露组、次暴露组、次暴露组、次暴露 (激活剂)组,每组 只。对照组吸入 的氧气 ;次暴露组仅在大鼠出生第 日吸入体积分数为 的七氟烷、氧气 ,其余日期仅吸入 的氧气;次暴露组在大鼠出生后第 、日均吸入体积分数为 的七氟烷、氧气 ,其余日期仅吸入 的氧气;次暴露组在大鼠出生后第 、日均吸入体积分 ,()数为 的七氟烷、氧气 ;次暴露 组在每次吸入七氟烷之后腹腔注
8、射 ;其余各组腹腔注射等体积生理盐水。实验期间无大鼠死亡。水迷宫检测大鼠学习记忆能力七氟烷暴露结束 周后(出生 ),采用 水迷宫实验对大鼠的学习记忆能力进行测定 。水迷宫为高 、直径 的圆柱形水池,水池共分为 个均等的象限,分别为、象限。实验过程中水温保持在 ,加入氧化钛使得水池内的水表现为乳白色(不透明)。将直径为 的圆形平台低于水面 置于第象限中央,记录大鼠从入水到找到平台的时间(潜伏期)及游过平台的次数。在大鼠出生后第 日开始实验,前 进行定向巡航实验。将大鼠每天同一时间从第、象限区域投入水中,记录其寻找并爬上平台的时间,记为潜伏期。潜伏期越大表明大鼠学习能力越差。若大鼠在 内仍未找到平
9、台,则指引其爬上平台并停留 ,此时潜伏期记为 。第 日将平台撤去,进行空间探索试验,记录 内大鼠穿越平台位置的次数。次数越多表明大鼠记忆能力越强。大鼠海马组织采集 水迷宫实验结束后,将各组大鼠麻醉,随机选取 只大鼠进行生理盐水、多聚甲醛 戊二醛灌注,当大鼠四肢僵硬后取大鼠海马 区组织用于海马神经元超微结构观察;将剩余的 只大鼠处死后剪开头部皮肤,依次切开肌肉、骨膜,钝性分离颅骨暴露脑组织,采集大鼠海马 区组织,只用于 染色、检测,只用于凋亡相关蛋白、通路相关蛋白的检测。大鼠海马组织超微结构观察及 染色从各组大鼠中随机选择 只,取出海马组织,用 的戊二醛固定约 ,用 将戊二醛冲洗掉,于 的锇酸溶
10、液再次固定 ,用梯度乙醇 丙酮进行脱水处理,经过环氧树脂包埋后切成薄片,用醋酸铀、柠檬酸铅染色后在透射电镜下观察、拍照并分析。从各组剩余的 只大鼠中随机选择 只,分离海马组织,用 的多聚甲醛固定约 ,将固定好的海马组织置于生物组织脱水机中进行脱水,然后进行透明和浸蜡处理,待包埋有海马组织的蜡块凝固后,将其切成厚度约为 的切片并贴附在载玻片上,根据 染色试剂盒的要求进行脱蜡、水化、苏木素染色、伊红染色、透明等处理,封片后于倒置显微镜下观察、拍照并分析。大鼠海马细胞凋亡率检测采用 法测定各组大鼠海马细胞凋亡情况。将 中制备的石蜡切片进行脱蜡处理,蛋白酶 消化后,加入 (溶于 )室温孵育 进行通透处
11、理,加入用 的过氧化氢(溶于 )室温孵育 以灭活切片内源性过氧化物酶;用 缓冲液冲洗两次后加入 生物素标记液,避光孵育 ;加入 反应终止液室温孵育 ,用 缓冲液冲洗两次;加入 工作液室温孵育 ,用 冲洗;加入 工作液进行显色处理约 ,经 缓冲液冲洗后用苏木素染液对细胞核进行复染,经过乙醇脱水、二甲苯透明后封片进行观察。神经元细胞凋亡率()棕褐色细胞(阳性细胞)视野总细胞 大鼠海马组织凋亡相关蛋白、通路蛋白表达检测采用蛋白免疫印迹(,)方法检测相关蛋白表达水平。取出各组剩余 只大鼠的海马组织,将组织切成小块,按照每 组织加入 裂解液的比例加入高效 组织裂解液,用组织匀浆机匀浆,将匀浆后的样品离心
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