UPLC-Q-Orbitrap HRMS结合全碳标记稳定同位素内标法精确测定粮油中黄曲霉毒素.pdf
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1、第 31 卷 2023 年 第 5 期 质量安全 创刊 30 周年专刊 粮油污染物检测及控制 170 杨永坛研究员主持“粮油污染物检测及控制”专栏文章之二 DOI:10.16210/ki.1007-7561.2023.05.020 叶金,刘彤彤,罗丽娟,等.UPLCQOrbitrap HRMS 结合全碳标记稳定同位素内标法精确测定粮油中黄曲霉毒素J.粮油食品科技,2023,31(5):170-178.YE J,LIU T T,LUO L J,et al.Accurate determination of aflatoxin in grains and oils use liquid chrom
2、atography mass spectrometry purified by automatic solid phase extraction instrument and quantified by fully 13C-Labelled internal standardsJ.Science and Technology of Cereals,Oils and Foods,2023,31(5):170-178.UPLCQOrbitrap HRMS 结合全碳 标记稳定同位素内标法精确 测定粮油中黄曲霉毒素 叶 金1,刘彤彤1,罗丽娟2,吴 宇1,李 丽1,王松雪1(1.国家粮食和物资储备局科
3、学研究院 粮油质量安全研究所,北京 100037;2.上海理工大学 健康科学与工程学院,上海 200093)摘 要:建立了全自动免疫亲和柱净化超高效液相色谱四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)结合全碳标记稳定同位素内标法对粮油中四种黄曲霉毒素精确定量方法。样品准确称量后加入全碳标记稳定同位素内标,经 84/16(V/V)的乙腈/水提取、离心、稀释后,通过全自动固相萃取仪采用黄曲霉毒素免疫亲和柱进行全自动净化,净化液在 UPLC-Q-Orbitrap HRMS 上进行检测后采用内标法进行定量分析。结果表明:黄曲霉毒素的加标回收率为 84.7%104.6%,日
4、内相对标准偏差为 1.7%9.4%,日间精密度为 0.7%8.4%。采用本方法对国家标准物质的检测结果在赋值范围内,能够最大限度地降低实验人员工作量,提高工作效率,避免因人员操作失误导致的结果偏差,适用于粮油中黄曲霉毒素的精准测定,可满足日常检测和监测需求。关键词:全自动固相萃取仪;超高效液相色谱四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱;黄曲霉毒素;免疫亲和柱;全碳标记稳定同位素内标法 中图分类号:TS207;Q93 文献标识码:A 文章编号:1007-7561(2023)05-0170-09 网络首发时间:2023-09-12 09:45:15 网络首发地址:http:/ 收稿日期:2023-04-2
5、0 基金项目:国家重点研发计划(2022YFE0137500);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ZX2231);全国粮食和物资储备青年拔尖人才项目(QN 2022202)Supported by:National Key Research and Development Program of China(No.2022YFE0137500);Fundamental Research Funds of the Central Research Institutes(No.ZX2231);Talent Project of National Food and Strategic Reser
6、ves Administration(No.QN 2022202)作者简介:叶金,男,1988 年出生,硕士,副研究员,研究方向为粮油质量安全检测及监测预警。E-mail: 通讯作者:吴宇,女,1988 年出生,硕士,助理研究员,研究方向为粮油质量安全检测。E-mail: 质量安全 第 31 卷 2023 年 第 5 期 粮油污染物检测及控制 创刊 30 周年专刊 171 Accurate Determination of Aflatoxin in Grains and Oils use Liquid Chromatography Mass Spectrometry Purified by A
7、utomatic Solid Phase Extraction Instrument and Quantified by Fully 13C-Labelled Internal Standards YE Jin1,LIU Tong-tong1,LUO Li-juan2,WU Yu1,LI Li1,WANG Song-xue1(1.Institute of Grain and Oil Quality and Safety,Academy of National Food and Strategic Reserves Administration,Beijing 100037,China;2.Sc
8、hool of Health Science Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)Abstract:An UPLC Quadrupole Orbitrap high resolution mass Spectrometry method for accurate quantification of aflatoxins in grains and oils was established,which were purified by automatic immun
9、oaffinity column.The sample was extracted with 84/16(V/V)acetonitrile/water and centrifuged.The supernatant was diluted 10 times with 0.1%PBST.Aflatoxin immunoaffinity column without background and recovery greater than 90%was chosen for purification automatically.UPLC-Quadrupole Orbitrap HRMS was u
10、sed for quantitative analysis.Results showed that recoveries for aflatoxins were 84.7%104.6%.The intra-day relative standard deviations were 1.7%9.4%,and the intra-day precision were 0.7%8.4%.The developed method can minimize the workload,improve work efficiency and avoid the result deviation caused
11、 by operation manually.It is suitable for the accurate determination of aflatoxins in grains and oils,and meet the requirement of the daily test and monitoring aflatoxins.Key words:automatic solid phase extraction instrument;ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high-resol
12、ution mass spectrometric;aflatoxin;immunoaffinity column;fully 13C isotope labeled internal standard calibration method 黄曲霉毒素(AFT)是由黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(a.parasiticus)产生的一类化学结构类似的二氢呋喃香豆素衍生物1。常见的有黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2四种,它们存在于土壤、动植物、各种坚果中,特别容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品,其中黄曲霉毒素 B1的毒性最大,被世界卫生组织列为 I 类致癌物。
13、其对人和动物有较强的致病性、致癌性,是危害最严重的真菌毒素之一,因此受到世界各国的广泛关注2。鉴于黄曲霉毒素对人类的危害,食品安全国家标准 GB27612017 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量规定了我国食品中黄曲霉毒素 B1的限量要求:玉米、花生仁、花生油以及玉米及花生制品中不得超过 20 g/kg,大米及其食用油不得超过 10 g/kg3。目前,现有检测食品中黄曲霉毒素的前处理方法主要包括薄层层析法4、酶联免疫吸附法5和胶体金试纸条法6、高效液相色谱法7、高效液相色谱质谱联用法8等。薄层层析法前处理操作繁琐,费力耗时,且重现性差;酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法多用于黄曲霉毒素的快速筛 查
14、,易受基质干扰影响出现假阳性;现普遍使用的免疫亲和柱层析高效液相色谱法,具有净化效果好,检测准确性高等特点,但该方法需过柱、氮吹、复溶,因此操作复杂、耗时、费力,对操作人员技术水平要求高;高效液相色谱质谱联用法适用于多种真菌毒素同时定性定量检测,有较高的灵敏度和稳定性,并具有一定的抗干扰能力等特点,但现有免亲和柱或者固相萃取柱通常需要手动净化,操作复杂、耗时长,且容易引入人为因素误差等。基于上述问题,为提高检测效率,并降低人为操作引入的误差,本研究拟采用全自动固相萃取仪结合免疫亲和柱净化技术建立全自动免疫亲和柱固相萃取超高效液相色谱质谱法联用检测粮油中黄曲霉毒素的方法。该方法无需氮吹复溶、前处
15、理简单、省时省力、定量准确、稳定性良好、环境和人员健康友好,适用于复杂基质样品中黄曲霉毒素的检测。第 31 卷 2023 年 第 5 期 质量安全 创刊 30 周年专刊 粮油污染物检测及控制 172 1 材料和方法 1.1 材料与仪器 甲醇、乙腈:Merk,色谱纯;PBS 盐包、吐温-20:Sigma,色谱纯;超纯水:Waston;Evergreen TREA 黄曲霉毒素免疫亲和柱:中检环贸生物技术(北京)有限公司;GBW(E)100386 玉米全粉黄曲霉毒素 B1成分标准物质、GBW(E)100604 花生油中黄曲霉毒素 B1成分分析标准物质、GBW(E)100606 大米粉中玉米赤霉烯酮和
16、黄曲霉毒素成分分析标准物质、玉米、小麦、糙米、大米、花生油空白:国家粮食和物资储备局科学研究院;黄曲霉毒素 B1(4.0 g/mL,AFB1)、黄曲霉毒素 B2(1.0 g/mL,AFB2)、黄曲霉毒素 G1(1.0 g/mL,AFG1)、黄曲霉毒素 G2(1.0 g/mL,AFG2)、13C17-黄曲霉毒素 B1(0.5 g/mL,13C17-AFB1)、13C17-黄曲霉毒素 B2(0.5 g/mL,13C17-AFB2)、13C17-黄曲霉毒素 G1(0.5 g/mL,13C17-AFG1)、13C17-黄曲霉毒素 G2(0.5 g/mL,13C17-AFG2):ROMER。Fotect
17、or Plus 全自动固相萃取仪:睿科仪器有限公司;四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive:Thermo Fisher Scientific 公司。1.2 标准溶液的配制 黄曲霉毒素混标溶液(AFS)的配制:取333.3 L 3.00 g/mLAFB1、83.3 L 3.00 g/mLAFB2、83.3 L 3.00 g/mLAFG1、83.3 L 3.00 g/mLAFG2分别于 1 mL 棕色小瓶中,加入 416.8 L 甲醇混合均匀后得到浓度为 1.00 g/mL,AFB1、0.25 g/mL,AFB2、0.25 g/mL,AFG1、0.25 g/mL,AFG2的混标即 A
18、FB1、AFB2、AFG1、AFG2的浓度比为4111。黄曲霉毒素混合内标溶液(13C17-AFS)的配制:取 400 L 0.50 g/mL13C17-AFB1、100 L 0.50 g/mL13C17-AFB2、100 L 0.50 g/mL13C17-AFG1、100 L 0.50 g/mL13C17-AFG2分别于 1 mL棕色小瓶中,加入 300 L 甲醇混合均匀后得到浓度为 0.20 g/mL13C17-AFB1、0.05 g/mL13C17-AFB2、0.05 g/mL13C17-AFG1、0.05 g/mL13C17-AFG2的混标,即13C17-AFB1、13C17-AFB2
19、、13C17-AFG1、13C17-AFG2的浓度比为 4111。1.3 仪器条件 色谱条件:Waters CORTECTS C18 柱(2.1 100 mm,1.6 m);柱温:40;流动相:A 为甲醇,B 为含 0.1%(体积分数)的甲酸和 1 mmol/L乙酸铵的水溶液,流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:0 min,70%B;6 min,50%B;6.1 min,5%B;7 min,5%B;7.1 min,70%B;10 min,70%B。流速为 0.2 mL/min,进样量为 2 L。质谱条件:加热电喷雾离子源(HESI)温度为 300;毛细管电压为 3.2 kV;离子传输管温
20、度为 320;鞘气为 35 unit;辅助气为 10 unit;黄曲霉毒素质谱参数见表 1。表 1 黄曲霉毒素的分子式、保留时间(RT)和质谱参数 Table 1 Formula,retention times(RT)and mass parameters of aflatoxins 化合物名称 分子式 加合形式 保留时间/min 母离子/(m/z)质量偏差/(ppm)子离子/(m/z)Aflatoxin B1 C17H12O6 M+H 5.52 313.070 010.720 0 214.062 4、241.049 5、269.044 4、285.075 7Aflatoxin B2 C17H
21、14O6 M+H 4.96 315.086 180.891 6 243.065 2、259.060 1、287.091 4、297.075 7Aflatoxin G1 C17H12O7 M+H 4.10 329.063 780.827 7 215.070 3、243.065 2、283.060 1、311.055 0Aflatoxin G2 C17H14O7 M+H 3.65 331.080 660.621 7 189.054 6、217.085 9、245.080 8、285.075 7 Targeted-SIM 模式;极性(Polarity):正离子模式;扫描范围(Scan range):
22、250800 m/z;分辨率(Resolution):70 000;自动增益控制(AGC target):5e5;最大驻留时间(Maximum IT):20 ms;同时扫描的母离子数(MSX count):5;质荷比宽度(Isolution window):1.5 m/z。Fullscan 模式:极性(Polarity):正离子模式;扫描范围(Scan range):250800 m/z;分辨率(Resolution):70 000;自动增益控制(AGC target):5e5;最大驻留时间(Maximum IT):20 ms。质量安全 第 31 卷 2023 年 第 5 期 粮油污染物检测及
23、控制 创刊 30 周年专刊 173 PRM 模式:极性(Polarity):正离子模式;分辨率(Resolution):70 000;自动增益控制(AGC target):5e5;最大驻留时间(Maximum IT):20 ms,质荷比分离宽度(Isolution window):1.5 m/z,归一化碰撞能量(NCE):50。1.4 样品前处理方法 准确称取 5 g(0.01g)样品,加入 125 L13C17-AFS 稳定同位素内标,加入 20 mL 的 84%乙腈水,涡旋提取 20 min,7 000 rpm 离心 5 min,取4 mL 上清液加入 46 mL 0.1%PBST 缓冲液
24、于全自动固相萃取仪的 80 mL 上样管内,运行编辑好的 方法对样品进行自动净化(具体步骤见表 2),将自动收集的洗脱液过 0.2 m PTFE 滤膜后上机检测。2 结果与讨论 2.1 色谱梯度优化 为使四种黄曲霉毒素的响应和峰形最佳以确保灵敏度最高,实验考察了 AFB1浓度为 5.00 g/L,AFB2、AFG1、AFG2浓度为 1.25 g/L 时,5 个不同的液相色谱梯度对四种黄曲霉毒素的色谱分离情况。如图 1 所示,流动相:A 为甲醇,B 为含0.1%(体积分数)的甲酸和 1 mmol/L 乙酸铵的水溶液,流速:0.3 m L/min,梯度洗脱条件:0 min,70%B;6 min,5
25、0%B;6.1 min,5%B;7 min,5%B;7.1 min,70%B;10 min,70%B 时四种黄曲霉毒素能够基线分离,且干扰峰与黄曲霉毒素 B1分开,提高了 AFB1检测灵敏度、稳定性、准确性。表 2 全自动固相萃取仪免疫亲和柱净化步骤 Table 2 Purification procedure of immune affinity column for automatic solid phase extraction instrument 序号 命令 溶剂 排出 流速/(mL/min)体积/mL 时间/min 1 清洗样品通道 H2O 2.8 2 填充样品路径 H2O 40
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