TCDD对胶质母细胞瘤中环氧合酶2基因表达的影响和生物学作用.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:国家自然科学基金青年项目(22206202);国家自然科学基金重点项目(21836004);国家重点研发计划项目(2018YFA0901100)第一作者:彭颖蓓(1998),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E-mail:ybpeng_ *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230410003彭颖蓓,陈旸升,刘奕耘,等.TCDD 对胶质
2、母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用J.生态毒理学报,2023,18(4):241-252Peng Y B,Chen Y S,Liu Y Y,et al.Effect of TCDD on expression of cyclooxygenase-2 gene and its biological role in glioblastoma J.Asian Journalof Ecotoxicology,2023,18(4):241-252(in Chinese)TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用彭颖蓓1,2,陈旸升1,*,刘奕耘3,李云平4,徐丽1
3、,谢群慧1,赵斌1,2,41.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京 1000852.中国科学院大学资源与环境学院,北京 1000493.重庆医科大学公共卫生学院,重庆 4000304.国科大杭州高等研究院环境学院,杭州 310024收稿日期:2023-04-10 录用日期:2023-05-22摘要:胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常见的恶性脑肿瘤,其复发率和死亡率居高不下。环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX2)在正常生理条件下几乎不表达,但持续高表达的 COX2 常见于各种恶性肿瘤和癌前状态,并参与诸多肿瘤发生发展过程,如
4、血管生成、免疫抑制、迁移侵袭以及化疗抵抗等。二噁英类污染物作为一级致癌物,但目前有关二噁英对 GBM 发展的研究十分有限。本研究旨在探究二噁英暴露影响 GBM 发展的分子机制。以 COX2 为标志物,明确二噁英类污染物中毒性最强的 2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)对胶质母细胞瘤 U87 细胞中COX2基因表达的影响以?及芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)在之中的作用,并借助转录组测序进一步探究 TCDD 暴露后 U87 细胞中COX2参与的生物过程。实验结果显示,TCDD
5、 以 AhR 依赖的方式上调 U87 细胞中COX2基因表达并具有时间-剂量依赖效应。转?录组分析结果表明,TCDD 暴露显著改变了 U87 细胞中细胞黏附、胞外刺激检测以及膜转运等相关通路的基因表达,COX2可?能通过影响脂质形成和维持炎症反应参与 U87 的改变。进一步的互作分析发现COX2基因与 IL1B 和 CYP2E1 相关。本研?究补充了 TCDD 在 U87 细胞中上调COX2表达的可能机制和影响,并为今后对二噁英促癌作用的研究提供参考。关键词:二噁英;胶质母细胞瘤 U87 细胞;环氧合酶 2(COX2);转录组分析;芳香烃受体文章编号:1673-5897(2023)4-241-
6、12 中图分类号:X171.5 文献标识码:AEffect of TCDD on Expression of Cyclooxygenase-2 Gene and Its Biologi-cal Role in GlioblastomaPeng Yingbei1,2,Chen Yangsheng1,*,Liu Yiyun3,Li Yunping4,Xu Li1,Xie Qunhui1,Zhao Bin1,2,41.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-En
7、vironmental Sciences,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100085,China2.College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China3.College of Public Health,Chongqing Medical University,Chongqing 400030,China4.School of Environment,Hangzhou Institute for Advanc
8、ed Study,University of Chinese Academy of Sciences,Hangzhou 310024,ChinaReceived 10 April 2023 accepted 22 May 2023242 生态毒理学报第 18 卷Abstract:Glioblastoma(GBM)is the most common malignant brain tumor which has high recurrence and mortal-ity rate.Cyclooxygenase 2(COX2)is not expressed under normal phys
9、iological conditions,but the continuouslyhigh expression of COX2 is common in various malignant tumors and precancerous states.COX2 is involved inmany tumors physiological activities,such as angiogenesis,immunosuppression,migration invasion,and chemo-therapy resistance.As primary carcinogen,the rese
10、arch about dioxin on glioblastoma occurrence and developmentis very limited.This study is aimed to investigate the effect and mechanism of dioxin on the expression ofCOX2gene and its subsequent effects on glioblastoma.We investigated the effect of dioxin onCOX2gene expression inglioblastoma U87 cell
11、s and the role of aryl hydrocarbon receptor(AhR).Throughin vitrocell experiments,the?most toxic dioxin,2,3,7,8-dibenzo-p-dioxin(TCDD),was used as a representative pollutant to explore whetherdioxin can change the expression ofCOX2gene through the classical AhR pathway in U87 cell.Finally,transcrip-?
12、tome sequencing was used to further explore the biological role ofCOX2in U87 cells after TCDD treatment.Theexperimental results showed that TCDD could upregulate the expression ofCOX2gene in U87 cells in an AhR-de-?pendent manner and had significant time-dependent and dose-dependent effects.The resu
13、lts of transcriptome analy-sis showed that TCDD exposure significantly altered cell adhesion,extracellular stimulation detection,and mem-brane transport pathways in U87 cells,andCOX2perhaps participate in the change of U87 by affecting lipid for-?mation and maintaining inflammatory response.Through
14、further interaction analysis,we found thatCOX2gene?was associated with IL1B and CYP2E1.This study supplements the possible mechanism and influence of TCDDupregulatingCOX2expression in U87 cells,and provides more details for future researches on the cancer promo-?ting effect of dioxins.Keywords:dioxi
15、n(TCDD);glioblastoma(U87 cell);cyclooxygenase 2(COX2);transcriptome analysis;aryl hy-drocarbon receptor(AhR)胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是恶性程度最高的脑肿瘤1,占成人恶性原发脑肿瘤的 70%,是最常见的恶性脑肿瘤2。GBM 起源于脑或脊髓中的神经元或星形胶质细胞,患者癌症进程进展迅速,中位总生存期仅为 16 21 个月3,其标准治疗手段一般包括手术切除和放化疗,然而由于 GBM 的弥漫性,无法通过手术切除全部的病灶,导致以现有手段无法治愈,GBM 的复发率和死亡率居
16、高不下。环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX2)能催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)转化为前列腺素(prostaglan-din,PG),其编码基因为PTGS2。COX2 在正常生理?条件下几乎不表达,但在组织器官受损后被显著上调,参与炎症反应并通过诱导上皮间充质转化增强细胞存活以促进组织再生4。持续高表达的 COX2常见于各种恶性肿瘤和癌前状态,如 GBM5、乳腺癌6和宫颈癌症7等,并参与诸多肿瘤生理活动,如血管生成、免疫抑制、迁移侵袭以及化疗抵抗等8-10。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)通路是介导二噁英化合物
17、毒性作用的经典路径11,在生殖、心血管和免疫等发育和功能作用中扮演着至关重要的角色12。二噁英以配体的形式与 AhR 结合后,能够显著上调以CYP1A1和CYP1B1为代表?的 P450 酶家族,并影响诸多基因的转录表达进而导致机体各种生理功能紊乱。AhR 参与 COX2 表达调控已在多种肿瘤中被证实,但 AhR 与 COX2 之间的关系仍存在争议。在 GBM 中,COX2 能通过催化生成前列腺素 E2(PGE2)促进肿瘤中 AhR 内源性激动剂表达上调,进而促进肿瘤免疫逃逸13。而在食管鳞状细胞癌中,AhR 激动剂 3,3-二吲哚甲烷(3,3-diindolylmethane,DIM)能够降
18、低 COX2/PGE2 表达,最终逆转癌细胞上皮间充质转化,减缓癌症进程14;在乳腺癌中,AhR 激活降低了细胞凋亡标志蛋白(B-cell lymphoma 2,BCL2)、COX2 和干细胞标志蛋白 SRY 盒转录因子 4(SRY-box transcriptionfactor 4,SOX4)的表达水平,并选择性地增加了肿瘤抑制基因P53的表达,促进癌细胞凋亡,在体内外实验中均能抑制乳腺癌细胞增殖15。大量研究流行病学数据和体内外实验证明二噁英参与多种肿瘤的发生发展16-19。越战退伍军人总癌症发病率相较一般人群显著增加,在 500 多名女性越战退伍军人中生殖相关肿瘤发病率最高,所有退伍军人
19、中枢神经系统癌变风险极高20。二噁英能第 4 期彭颖蓓等:TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用243 够扰乱生物体内分泌系统的正常工作,进而引起神经系统发育异常、机体代谢紊乱,促进癌症的发生发展21。二噁英类污染物具有神经毒性。研究表明,父母职业接触农药或住宅接触农药与儿童脑肿瘤发生之间存在关联22;2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)暴露会导致机体神经系统发育异常,且 TCDD 可以通过 AhR 破坏神经内分泌系统的功能结构,影响脊椎动物神经系统中神经元以及胶质细胞的增殖、分化和存
20、活23。二噁英经典毒性作用靶点 AhR 在 GBM 中过表达,并随胶质瘤恶性程度升高表达增加24。在 GBM 中,内源性的犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)能通过激活AhR 进而促进肿瘤增殖、维持肿瘤干细胞的干性以及促进免疫抑制微环境形成,色氨酸-2,3-双加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase,TDO)和 AhR 调节基因的表达与 GBM 的恶性进展和低生存率有关25。二噁英能以 AhR 依赖的方式诱导 COX2 在多种组织中表达,如成纤维细胞26、子宫内膜细胞27、造血干细胞28以及人肺癌细胞29,但关于二噁英化合物与GBM 发生发展之间的关系有待进一步探究。本
21、研究旨在探究二噁英能否通过引起胶质母细胞瘤 U87 细胞中 COX2 的改变进而促进肿瘤发展。通过体外细胞实验,以毒性最强的二噁英 2,3,7,8-TCDD 为代表性污染物,明确二噁英污染物能否通过经典的 AhR 通路在 U87 细胞中引起下游COX2基因表达量的变化;通过转录组测序进一步分析?COX2 在 TCDD 暴露后 U87 细胞中经历的生理活动转变。本研究有助于扩展对二噁英在 GBM 发展过程影响机制上的认识,明晰 AhR 在这一过程中的作用和挖掘未知的下游功能基因,并为今后二噁英促癌作用的相关研究提供一些参考,也为以 AhR 为靶点开发的新型抗肿瘤药物提供数据支持。1 材料与方法(
22、Materials and methods)1.1 材料人胶质母细胞瘤细胞系 U87 购自中国医学科学院细胞资源中心。DMEM 培养基、0.25%胰酶、青霉素/链霉素、胎牛血清均购自 Gibco 公司;二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;纯度 99.9%)购自 Sig-ma 公司,2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlo-rodibenzo-p-dioxin,TCDD;纯度 99.9%)购自 Wel-lington 公 司。荧 光 定 量 PCR 仪(4485694,Life,USA),PCR 仪(T100TM,BIO-RAD,USA)。1.
23、2 细胞培养和传代使用 DMEM 空白培养基混合 10%胎牛血清、100 U mL-1青霉素和 100 g mL-1的链霉素配制为全培养基培养 U87 细胞。2 种细胞均培养在 5%CO2、饱和湿度的 37 恒温培养箱中。当细胞生长至 80%90%时,使用 0.25%的胰酶消化,按13 传代。1.3 AhR 干扰 RNA 转染干扰 RNA 转染实验按照 RNAiMAX Transfec-tion Reagent(Invitrogen)说明书进行。首先接种 5105个细胞于 6 孔板中,培养 24 h 后,待细胞覆盖 6孔板底面 80%时进行转染。配制转染试剂时,先使用无血清 Opti-MEM
24、培养基分别稀释试剂 Lipo-fectamine RNAiMAX 和 AhR siRNA,之后两液体按1 1 的比例涡旋混合至均匀。混合后的溶剂室温放置5 min 后,6 孔板的每孔加入250 L 干扰试剂,使得孔中干扰 RNA 含量为 50 pmol,培养箱中孵育 24h 后进行后续实验。正式实验前需对干扰 RNA 的干扰效率进行检测,通过检测目标基因的表达水平计算干扰效率。本实验中的 siRNA 序列如表1 所示。表 1 AhR siRNA 序列Table 1 The sequence of AhR siRNA基因Gene干扰 RNA 序列siRNA sequence阴性对照(NC)Neg
25、ative control(NC)5-UUCUCCGAACGUGUCACCUTT-35-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3AhR5-AGGGAAAGAUGGAUCAAUATT-35-UAUUGAUCCAUCUUUCCCUTT-31.4 总 RNA 提取与 cDNA 合成RNA 提取采用纯化柱法,GeneJETRNA(Ther-mo)纯化试剂盒被用于提取细胞内总 RNA。Rever-tiAid First Strand cDNA Synthesis(Thermo)试剂盒被用于进行逆转录实验。使用 NanoDrop 2000/2000c分光光度计检测提取的 RNA 质量和浓度。之后使用
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