TCDD对胶质母细胞瘤中环氧合酶2基因表达的影响和生物学作用.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:国家自然科学基金青年项目(22206202);国家自然科学基金重点项目(21836004);国家重点研发计划项目(2018YFA0901100)第一作者:彭颖蓓(1998),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E-mail:ybpeng_ *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230410003彭颖蓓,陈旸升,刘奕耘,等.TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用J.生态毒理学报,2023,18(4):241-252Peng Y B,Chen Y S,Liu Y Y,et al.Effect of TCDD on expression of cyclooxygenase-2 gene and its biological role in glioblastoma J.Asian Journalof Ecotoxicology,2023,18(4):241-252(in Chinese)TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用彭颖蓓1,2,陈旸升1,*,刘奕耘3,李云平4,徐丽1,谢群慧1,赵斌1,2,41.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京 1000852.中国科学院大学资源与环境学院,北京 1000493.重庆医科大学公共卫生学院,重庆 4000304.国科大杭州高等研究院环境学院,杭州 310024收稿日期:2023-04-10 录用日期:2023-05-22摘要:胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常见的恶性脑肿瘤,其复发率和死亡率居高不下。环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX2)在正常生理条件下几乎不表达,但持续高表达的 COX2 常见于各种恶性肿瘤和癌前状态,并参与诸多肿瘤发生发展过程,如血管生成、免疫抑制、迁移侵袭以及化疗抵抗等。二噁英类污染物作为一级致癌物,但目前有关二噁英对 GBM 发展的研究十分有限。本研究旨在探究二噁英暴露影响 GBM 发展的分子机制。以 COX2 为标志物,明确二噁英类污染物中毒性最强的 2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)对胶质母细胞瘤 U87 细胞中COX2基因表达的影响以?及芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)在之中的作用,并借助转录组测序进一步探究 TCDD 暴露后 U87 细胞中COX2参与的生物过程。实验结果显示,TCDD 以 AhR 依赖的方式上调 U87 细胞中COX2基因表达并具有时间-剂量依赖效应。转?录组分析结果表明,TCDD 暴露显著改变了 U87 细胞中细胞黏附、胞外刺激检测以及膜转运等相关通路的基因表达,COX2可?能通过影响脂质形成和维持炎症反应参与 U87 的改变。进一步的互作分析发现COX2基因与 IL1B 和 CYP2E1 相关。本研?究补充了 TCDD 在 U87 细胞中上调COX2表达的可能机制和影响,并为今后对二噁英促癌作用的研究提供参考。关键词:二噁英;胶质母细胞瘤 U87 细胞;环氧合酶 2(COX2);转录组分析;芳香烃受体文章编号:1673-5897(2023)4-241-12 中图分类号:X171.5 文献标识码:AEffect of TCDD on Expression of Cyclooxygenase-2 Gene and Its Biologi-cal Role in GlioblastomaPeng Yingbei1,2,Chen Yangsheng1,*,Liu Yiyun3,Li Yunping4,Xu Li1,Xie Qunhui1,Zhao Bin1,2,41.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-Environmental Sciences,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100085,China2.College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China3.College of Public Health,Chongqing Medical University,Chongqing 400030,China4.School of Environment,Hangzhou Institute for Advanced Study,University of Chinese Academy of Sciences,Hangzhou 310024,ChinaReceived 10 April 2023 accepted 22 May 2023242 生态毒理学报第 18 卷Abstract:Glioblastoma(GBM)is the most common malignant brain tumor which has high recurrence and mortal-ity rate.Cyclooxygenase 2(COX2)is not expressed under normal physiological conditions,but the continuouslyhigh expression of COX2 is common in various malignant tumors and precancerous states.COX2 is involved inmany tumors physiological activities,such as angiogenesis,immunosuppression,migration invasion,and chemo-therapy resistance.As primary carcinogen,the research about dioxin on glioblastoma occurrence and developmentis very limited.This study is aimed to investigate the effect and mechanism of dioxin on the expression ofCOX2gene and its subsequent effects on glioblastoma.We investigated the effect of dioxin onCOX2gene expression inglioblastoma U87 cells and the role of aryl hydrocarbon receptor(AhR).Throughin vitrocell experiments,the?most toxic dioxin,2,3,7,8-dibenzo-p-dioxin(TCDD),was used as a representative pollutant to explore whetherdioxin can change the expression ofCOX2gene through the classical AhR pathway in U87 cell.Finally,transcrip-?tome sequencing was used to further explore the biological role ofCOX2in U87 cells after TCDD treatment.Theexperimental results showed that TCDD could upregulate the expression ofCOX2gene in U87 cells in an AhR-de-?pendent manner and had significant time-dependent and dose-dependent effects.The results of transcriptome analy-sis showed that TCDD exposure significantly altered cell adhesion,extracellular stimulation detection,and mem-brane transport pathways in U87 cells,andCOX2perhaps participate in the change of U87 by affecting lipid for-?mation and maintaining inflammatory response.Through further interaction analysis,we found thatCOX2gene?was associated with IL1B and CYP2E1.This study supplements the possible mechanism and influence of TCDDupregulatingCOX2expression in U87 cells,and provides more details for future researches on the cancer promo-?ting effect of dioxins.Keywords:dioxin(TCDD);glioblastoma(U87 cell);cyclooxygenase 2(COX2);transcriptome analysis;aryl hy-drocarbon receptor(AhR)胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是恶性程度最高的脑肿瘤1,占成人恶性原发脑肿瘤的 70%,是最常见的恶性脑肿瘤2。GBM 起源于脑或脊髓中的神经元或星形胶质细胞,患者癌症进程进展迅速,中位总生存期仅为 16 21 个月3,其标准治疗手段一般包括手术切除和放化疗,然而由于 GBM 的弥漫性,无法通过手术切除全部的病灶,导致以现有手段无法治愈,GBM 的复发率和死亡率居高不下。环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX2)能催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)转化为前列腺素(prostaglan-din,PG),其编码基因为PTGS2。COX2 在正常生理?条件下几乎不表达,但在组织器官受损后被显著上调,参与炎症反应并通过诱导上皮间充质转化增强细胞存活以促进组织再生4。持续高表达的 COX2常见于各种恶性肿瘤和癌前状态,如 GBM5、乳腺癌6和宫颈癌症7等,并参与诸多肿瘤生理活动,如血管生成、免疫抑制、迁移侵袭以及化疗抵抗等8-10。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)通路是介导二噁英化合物毒性作用的经典路径11,在生殖、心血管和免疫等发育和功能作用中扮演着至关重要的角色12。二噁英以配体的形式与 AhR 结合后,能够显著上调以CYP1A1和CYP1B1为代表?的 P450 酶家族,并影响诸多基因的转录表达进而导致机体各种生理功能紊乱。AhR 参与 COX2 表达调控已在多种肿瘤中被证实,但 AhR 与 COX2 之间的关系仍存在争议。在 GBM 中,COX2 能通过催化生成前列腺素 E2(PGE2)促进肿瘤中 AhR 内源性激动剂表达上调,进而促进肿瘤免疫逃逸13。而在食管鳞状细胞癌中,AhR 激动剂 3,3-二吲哚甲烷(3,3-diindolylmethane,DIM)能够降低 COX2/PGE2 表达,最终逆转癌细胞上皮间充质转化,减缓癌症进程14;在乳腺癌中,AhR 激活降低了细胞凋亡标志蛋白(B-cell lymphoma 2,BCL2)、COX2 和干细胞标志蛋白 SRY 盒转录因子 4(SRY-box transcriptionfactor 4,SOX4)的表达水平,并选择性地增加了肿瘤抑制基因P53的表达,促进癌细胞凋亡,在体内外实验中均能抑制乳腺癌细胞增殖15。大量研究流行病学数据和体内外实验证明二噁英参与多种肿瘤的发生发展16-19。越战退伍军人总癌症发病率相较一般人群显著增加,在 500 多名女性越战退伍军人中生殖相关肿瘤发病率最高,所有退伍军人中枢神经系统癌变风险极高20。二噁英能第 4 期彭颖蓓等:TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用243 够扰乱生物体内分泌系统的正常工作,进而引起神经系统发育异常、机体代谢紊乱,促进癌症的发生发展21。二噁英类污染物具有神经毒性。研究表明,父母职业接触农药或住宅接触农药与儿童脑肿瘤发生之间存在关联22;2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)暴露会导致机体神经系统发育异常,且 TCDD 可以通过 AhR 破坏神经内分泌系统的功能结构,影响脊椎动物神经系统中神经元以及胶质细胞的增殖、分化和存活23。二噁英经典毒性作用靶点 AhR 在 GBM 中过表达,并随胶质瘤恶性程度升高表达增加24。在 GBM 中,内源性的犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)能通过激活AhR 进而促进肿瘤增殖、维持肿瘤干细胞的干性以及促进免疫抑制微环境形成,色氨酸-2,3-双加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase,TDO)和 AhR 调节基因的表达与 GBM 的恶性进展和低生存率有关25。二噁英能以 AhR 依赖的方式诱导 COX2 在多种组织中表达,如成纤维细胞26、子宫内膜细胞27、造血干细胞28以及人肺癌细胞29,但关于二噁英化合物与GBM 发生发展之间的关系有待进一步探究。本研究旨在探究二噁英能否通过引起胶质母细胞瘤 U87 细胞中 COX2 的改变进而促进肿瘤发展。通过体外细胞实验,以毒性最强的二噁英 2,3,7,8-TCDD 为代表性污染物,明确二噁英污染物能否通过经典的 AhR 通路在 U87 细胞中引起下游COX2基因表达量的变化;通过转录组测序进一步分析?COX2 在 TCDD 暴露后 U87 细胞中经历的生理活动转变。本研究有助于扩展对二噁英在 GBM 发展过程影响机制上的认识,明晰 AhR 在这一过程中的作用和挖掘未知的下游功能基因,并为今后二噁英促癌作用的相关研究提供一些参考,也为以 AhR 为靶点开发的新型抗肿瘤药物提供数据支持。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 材料人胶质母细胞瘤细胞系 U87 购自中国医学科学院细胞资源中心。DMEM 培养基、0.25%胰酶、青霉素/链霉素、胎牛血清均购自 Gibco 公司;二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;纯度 99.9%)购自 Sig-ma 公司,2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlo-rodibenzo-p-dioxin,TCDD;纯度 99.9%)购自 Wel-lington 公 司。荧 光 定 量 PCR 仪(4485694,Life,USA),PCR 仪(T100TM,BIO-RAD,USA)。1.2 细胞培养和传代使用 DMEM 空白培养基混合 10%胎牛血清、100 U mL-1青霉素和 100 g mL-1的链霉素配制为全培养基培养 U87 细胞。2 种细胞均培养在 5%CO2、饱和湿度的 37 恒温培养箱中。当细胞生长至 80%90%时,使用 0.25%的胰酶消化,按13 传代。1.3 AhR 干扰 RNA 转染干扰 RNA 转染实验按照 RNAiMAX Transfec-tion Reagent(Invitrogen)说明书进行。首先接种 5105个细胞于 6 孔板中,培养 24 h 后,待细胞覆盖 6孔板底面 80%时进行转染。配制转染试剂时,先使用无血清 Opti-MEM 培养基分别稀释试剂 Lipo-fectamine RNAiMAX 和 AhR siRNA,之后两液体按1 1 的比例涡旋混合至均匀。混合后的溶剂室温放置5 min 后,6 孔板的每孔加入250 L 干扰试剂,使得孔中干扰 RNA 含量为 50 pmol,培养箱中孵育 24h 后进行后续实验。正式实验前需对干扰 RNA 的干扰效率进行检测,通过检测目标基因的表达水平计算干扰效率。本实验中的 siRNA 序列如表1 所示。表 1 AhR siRNA 序列Table 1 The sequence of AhR siRNA基因Gene干扰 RNA 序列siRNA sequence阴性对照(NC)Negative control(NC)5-UUCUCCGAACGUGUCACCUTT-35-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3AhR5-AGGGAAAGAUGGAUCAAUATT-35-UAUUGAUCCAUCUUUCCCUTT-31.4 总 RNA 提取与 cDNA 合成RNA 提取采用纯化柱法,GeneJETRNA(Ther-mo)纯化试剂盒被用于提取细胞内总 RNA。Rever-tiAid First Strand cDNA Synthesis(Thermo)试剂盒被用于进行逆转录实验。使用 NanoDrop 2000/2000c分光光度计检测提取的 RNA 质量和浓度。之后使用无菌水将所有样品配制成总 RNA 量为 2 000 ng的 RNA 溶液,用于后续 cDNA 合成。首先混匀 11L 稀释后的 RNA 溶液、0.5 L Oligo(dT)18 和 0.5L Random Primer,配制总体积为 12 L 的 Mix1,待其在 PCR 仪65 加热5 min 后取出,再向每样品中加 入 4 L Reaction Buffer(5)、2 L dNTPMix、1 L RI 和 1 L RT,涡旋混匀后再次放入PCR 仪中,按如下程序进行反转录:25 孵育 5244 生态毒理学报第 18 卷min,42 加热1 h,70 加热5 min,4 冷却。-30冰箱储存 cDNA 样品。1.5 实时荧光定量 PCR 检测目标基因表达量反转 RNA 合成 cDNA 后,荧光定量 PCR 实验用于检测AhR、CYP1A1、CYP1B1和PTGS2的表达?量。qPCR 仪中热循环条件为:95 加热 2 min,95解旋15 s,60 下20 s 退火,72 延伸20 s,变性循环共 40 次。最终表达量通过 2-CT值法进行计?算分析。实验中,GAPDH表达恒定,被选定为内参?基因,每个样品设置 3 个平行复孔。以上基因的引物序列均基于 GenBank 网站中的 Primer-BLAST 功能设计而得,正式实验前所有引物均已进行过引物验证,效率在 0.9 1.1 之间。所有引物由生工生物科技公司(北京)合成,具体序列见表 2。1.6 转录组测序分析TCDD 处理 U87 细胞 48 h 后,根据说明书使用GeneJETRNA(Thermo)纯化试剂盒提取总 mRNA,在验证完整性和纯度后,将总 mRNA 随机断裂成约200 bp 的片段,并将 RNA 转录成双链 DNA。通过Illumina NovaSeq 6000 探测产生的 DNA 产物序列。为了确定 2 个不同样本之间的差异表达基因(differ-ent expressed genes,DEGs),根据每百万次读取的转录本方法计算每个转录本的表达水平,FC1.5、P0.05 的基因被定义为 DEGs。使用 DAVID 平台?(https:/david.ncifcrf.gov/home.jsp)对筛选出的 DEGs进行 KEGG 和 GO 富集分析,分析结果中P0.05?的通 路 被 认 为 具 有显著性。使用 Origin 2021(Northampton,MA,USA)进行绘图。使用 STRING11.5 在线平台(https:/cn.string-db.org/)进行蛋白相互作用分析。表 2 引物序列Table 2 Primer sequence基因Gene引物序列Primer sequencesGAPDH(F)5-ATGACCCCTTCATTGACC-3(R)5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3AhR(F)5-CTGAAGTCAACCTCACCAGAAAAAT-3(R)5-AAAAACAGTGACTTGTACAGCATAATGA-3COX2(PTGS2)(F)5-GCTAGACAGCGTAAACTGCG-3(R)5-CATCATCAGACCAGGCACCA-3CYP1B1(F)5-GGCCGGTACGTTCTCCAAATC-3(R)5-AACGTCATGAGTGCCGTGTGT-3CYP1A1(F)5-GGGTTGACCCATAGCTTCTG-3(R)5-TCCTGGAGACCTTCCGACAC-31.7 数据统计与分析实验结果的数据统计与分析通过 GraphPadprism(v.7,La Jolla,CA,USA)软件进行,数值结果以平均值标准误(n=3)显示,每次独立实验设置 3 次?平行。最后采用单因素或双因素方差分析(ANO-VA)和 Bonferroni 检验进行统计检验。P0.05 被认?为具有统计学意义,*表示P0.05,*为P0.01,?*为P0.001。2 结果(Results)2.1 TCDD 诱导 U87 细胞中COX2表达上调首先,探究了 TCDD 在 U87 细胞中对COX2基?因表达的影响及时间剂量效应关系。在 U87 中,10-8mol L-1TCDD 处理 24 h 后COX2基因表达量?发生了明显变化,其表达水平升高约 6 倍,在处理48 h 后,COX2的表达量增加至 40 多倍(图 1(a),说?明 TCDD 诱导COX2基因表达上调的作用具有时?间依赖性;10-13 10-8molL-1TCDD 处理 U87 细胞 48 h 后,COX2基因表达量随着 TCDD 浓度升高?而升高,具有明显的剂量依赖效应,在 10-10mol L-1TCDD 处理后,U87 中COX2的表达量上调 2 倍左?右,具有统计学意义(图 1(b)。2.2 AhR 信号通路介导了 TCDD 对COX2基因表?达的上调作用 分析了 10-8mol L-1TCDD 处理 U87 细胞后,12、24、48 h 处 U87 细胞中AhR基因和 AhR 通路下?游CYP1A1、CYP1B1基因的表达情况。在 U87 中,?AhR的表达量在 TCDD 处理后不同时间点处略有?降低但未发生显著性变化(图 2(a),而CYP1A1与?CYP1B1的表达量在 3 个时间点下均急剧升高,在?TCDD 处理 24 h 后,CYP1B1增至 10 倍左 右,?CYP1A1表达变化幅度更大,激增约 50 倍,且 2 个?基因的表达量均随 TCDD 处理时间延长持续升高(图2(b)和2(c)。在系列浓度 TCDD 处理下,U87 细胞中CYP1A1与CYP1B1的表达均显著上调,且?CYP1A1上调倍数同样高于CYP1B1。当 10-10?mol L-1TCDD 处理 U87 细胞后,CYP1A1上调 3?倍左右,相对CYP1B1对 TCDD 刺激的响应更显?著(图 2(d)。为进一步探究 AhR 通路在 TCDD 对COX2基?因表达调控中的作用,使用 AhR siRNA 处理 U87 细胞,观察AhR基因表达沉默后,TCDD 对AhR、?CYP1A1、CYP1B1和COX2(PTGS2)基因的表达影?响。并检测了 10-10molL-1和 10-9molL-1TCDD第 4 期彭颖蓓等:TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用245 处理后AhR和CYP1A1的表达量。结果显示,使用?AhR siRNA 沉默AhR基因表达后,AhR基因表达?下调约 50%(图 3(a)。同时,与 NC 组相比,AhR 通路被显著抑制,TCDD 对CYP1A1的表达上调作用?在AhR沉默后被大幅抑制,尤其是在 10-9molL-1?TCDD 暴露条件下由 60 倍降低至 20 倍(图 3(b)。AhR沉默后,COX2的表达与对照组没有明显变化,?但是,TCDD 对COX2的表达上调作用受到显著抑?制(图 3(c)。在 NC 组内 TCDD 处理显著上调了COX2的表达,但在 AhR siRNA 处理组中,虽然 TC-?DD 处理后,COX2表达仅略有增加,并没有显著差?异。同时,与 NC 组相比,AhR siRNA 处理组中10-10mol L-1和 10-9molL-1TCDD 使得COX2基?因的表达分别降低 2 倍和 4 倍,均被显著下调。图 1 TCDD 诱导 U87 细胞中COX2表达的时间和剂量效应注:(a)10-8mol L-1TCDD 处理 U87 细胞 12、24、48 h 后COX2(PTGS2)表达量变化的时间效应;(b)10-1310-8mol L-1TCDD 处理 U87 细胞 48 h 后COX2(PTGS2)表达量变化的剂量效应;与对照组相比,*P0.05,*P0.001。Fig.1 The dose effect and time effect of TCDD inducingCOX2expression in U87 cellsNote:(a)Time effect ofCOX2(PTGS2)expression in U87 cells treated with 10-8mol L-1TCDD for 12,24 and 48 h;(b)Dose effectofCOX2(PTGS2)expression after 10-1310-8mol L-1TCDD treatment of U87 cells for 48 h;compared with the control,*indicatessP0.05,and*indicatesP0.001.图 2 TCDD 处理对 U87 细胞中 AhR 信号通路的激活情况注:(a)、(b)、(c)10-8mol L-1TCDD 处理 U87 细胞 12、24、48 h 后AhR(a)、CYP1B1(b)和CYP1A1(c)的变化情况;(d)在 U87 细胞中,10-1210-8mol L-1TCDD 处理 48 h 后 AhR 下游标志基因CYP1A1和CYP1B1的表达变化情况;与对照组相比,*P0.001。Fig.2 The activation of AhR pathway in U87 cellsNote:(a),(b),(c)The expression change ofAhR(a),CYP1B1(b)andCYP1A1(c)in U87 cells after 10-8mol L-1TCDD treatmentfor 12,24,48 h;(d)The expression ofCYP1A1andCYP1B1in U87 cells after 10-1210-8mol L-1TCDD treatment for 48 h;compared with the control,*indicatesP0.001.246 生态毒理学报第 18 卷图 3 AhR siRNA 处理 U87 细胞后 AhR、CYP1A1 和 COX2(PTGS2)的变化情况注:(a)、(b)AhR siRNA 干扰后 U87 细胞以及 10-10mol L-1和 10-9mol L-1TCDD 处理后,AhR(a)和CYP1A1(b)的表达情况;(c)10-9mol L-1和 10-10mol L-1TCDD 处理 U87 细胞后COX2(PTGS2)表达量的变化;*表示与对照组相比具有显著性(*P0.05、*P0.01、*P0.001),#表示与 NC 组相比变化显著(#P0.01、#P0.001、#P0.0001)。Fig.3 Changes ofAhR,CYP1A1,COX2(PTGS2)after treatment of U87 cells with AhR siRNANote:(a),(b)The expression ofAhR(a)andCYP1A1(b)in U87 cells after 10-10mol L-1and 10-9mol L-1TCDD treatment;(c)Changes in the expression ofCOX2(PTGS2)in U87 cells treated with 10-9mol L-1and 10-10mol L-1TCDD;*indicates significantchanges compared to the control group(*P0.05,*P0.01,*P0.001),while#indicates significant changescompared to the NC group(#P0.01,#P0.001,#P1.5,P0.05),其中包括上调基因187 个,下调基因637 个,转录组中所有基因的火山图如图 4(a)所示。之后对筛选出的 DEGs 进行了 KEGG 和 GO 分析,结果如图 4 所示。KEGG 通路富集分析显示,TCDD 处理后,细胞通讯、细胞黏附和免疫相关通路更为活跃,尤其是细胞间相互作用相关通路,此外 NF-B 通路也被激活(图 4(b);GO 生物功能分析注释表现出与KEGG 相似的结果,最显著的几条富集通路显示细胞黏附、胞外刺激检测以及膜转运等功能活跃(图4(c)。2.3.2COX2主要参与脂质形成和炎症响应转录组分析结果与上文的细胞学实验结果一致,COX2的表达量在 TCDD 处理后相比对照组上?调 2.3 倍。GO 富集分析中COX2相关的且具有显?著性的通路共有 19 条(图 5)。其中,多肽酶活负向调节通路的显著性最高,炎症反应调节相关通路涉及最多的基因,总体而言COX2主要参与脂质形成?和炎症响应相关通路。2.3.3COX2的潜在调控分子机制为进一步了解COX2影响 U87 细胞生理活动?的作用机制,利用 DEGs 进行蛋白相互作用分析,并通过聚类筛选出 40 个与COX2相关的 DEGs,其相?互作用关系如图 6 所示,线条颜色深浅代表了两分子间联系的密切程度。其中IL1B处于网络中心,?且IL1B、CYP2E1、PTGER3、KNG1和CXCL12与?COX2相关,尤其是IL1B和CYP2E1。IL1B由免疫细胞、成纤维细胞或肿瘤细胞等多种细胞产生分泌,在正常情况下通过结合IL1R促进炎症发生参与先?天免疫活动,在肿瘤微环境中其表达增加可促进癌细胞增殖、新血管生成或肿瘤浸润免疫细胞30,TC-DD 处理后表达量增长约 2.2 倍;CYP2E1属于 P450?酶超家族,在肝脏中高表达,主要负责体内酒精、药物和环境毒素的代谢31,TCDD 处理后增长约2.9 倍。第 4 期彭颖蓓等:TCDD 对胶质母细胞瘤中环氧合酶 2 基因表达的影响和生物学作用247 图 4 转录组差异表达基因的火山图、KEGG 和 GO 分析注:(a)转录组中差异表达基因火山图;10-10mol L-1TCDD 处理后 U87 细胞中总体差异表达基因的 KEGG 富集通路(b)和 GO 分析(c)。Fig.4 KEGG and GO enrichment analysis of differentially expressed genesNote:(a)Volcano map of differentially expressed genes in transcriptome;KEGG(b)and GO(c)enrichment analysis oftotal differentially expressed genes in U87 cells after treating with 10-10mol L-1TCDD.因此,COX2可能通过与IL1B和CYP2E1的相互作?用影响 U87 细胞的脂质代谢过程并维持肿瘤内部炎症反应进而影响其免疫活动。3 讨论(Discussion)为探究二噁英污染物在 GBM 中能否诱导COX2表达,本研究以 TCDD 为代表性二噁英化合?物、U87 细胞为细胞模型进行体外实验。实验数据显示,TCDD 诱导COX2基因表达上调的作用具有?显著的时间依赖性和剂量依赖效应;AhR在 U87 细?胞中被 TCDD 显著激活,AhR下游基因CYP1A1相?较CYP1B1响应更强。AhR siRNA 干扰AhR表达?后 AhR 通路被大幅抑制,尤其是在高浓度 TCDD 刺激时抑制作用更明显,同时COX2基因的表达量在?TCDD 处理后相较 NC 组同样被显著下调。之后为进一步探究COX2表达上调的生理学意义,对 10-10248 生态毒理学报第 18 卷?mol L-1TCDD 处理48 h 后的 U87 细胞进行了转录组分析,DEGs 的 KEGG 和 GO 富集分析结果显示,TCDD 处理后,U87 细胞中细胞黏附、胞外刺激检测以及膜转运等功能活跃,此外COX2的上游 NF-B?通路也被激活。进一步分析COX2参与的 GO 富集分析中显著的通路,发现COX2主要参与脂质形成?和炎症响应等活动。最后,蛋白相互作用分析发现IL1B、CYP2E1、PTGER3、KNG1 和 CXCL12 与COX2 相关,尤其是 IL1B 和 CYP2E1,说明 COX2可能通过 IL1B 和 CYP2E1 影响 U87 细胞的炎症响应和脂质代谢过程(图 7)。前人研究显示 10-10molL-1TCDD 处理 U87细胞后,AhR表达水平相比对照组显著降低19,这?与本文图 3(a)中 NC 组 TCDD 处理后AhR表达水?平相对对照组显著降低的现象相符。AhR 结合配体后会与 AhR 核转位子相结合并转位入核启动下游基因转录,之后 AhR-配体复合物被转运到细胞质通过泛素/蛋白酶体系统被迅速降解,导致胞内 AhR存在水平下降32。虽然 TCDD 刺激后 AhR 的存在水平有所降低,但胞内 AhR 处于动态平衡,刺激后AhR 表达总量增高,导致胞内 AhR 通路活性很高。许多研究发现 AhR 在 GBM 的发展中起到重要作用,但不同配体激活 AhR 导致的下游效应不尽相同。犬尿氨酸能以自分泌的方式激活 GBM 细胞内的 AhR,促进细胞增殖、上调整合素表达,进而增强肿瘤侵袭性;AhR 能促进胶质瘤细胞分泌炎症因子IL6 并上调 IDO 表达;AhR 还能驱动 CD39 表达,通过 CD39 与 CD73 的相互作用生成免疫抑制性腺苷,以招募巨噬细胞,影响肿瘤生长33。GBM 中AhR 的激活还被发现与细胞迁移能力相关:Liu等19发现 AhR 过表达能增加 U87 细胞的迁移能力,相反,敲低 AhR 会抑制肿瘤细胞迁移,但在 AhR 激动剂 6-甲酰基3,2-b咔唑(6-formyl3,2-bcarbazole,FICZ)和 TCDD 激活下,U87 细胞通过 AhR 上调肿图 5 GO 分析中 COX2 参与通路Fig.5 Significant pathways involved in GO enrichment analysis第 4 期彭颖蓓